體外循環(huán)下室間隔缺損修補術(shù)對小兒中性粒細胞凋亡及其調(diào)控蛋白的影響.pdf

1、目的：體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)誘發(fā)機體全身炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response，SIRS)，中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)是人體對抗感染與異己物質(zhì)的第一道防線，在機體防御機制中起著關(guān)鍵性的作用。炎癥條件下，PMN大量激活，滲出后沉積于組織，造成周圍組織損傷。凋亡是PMN從炎癥部位非炎性清除的有效方式。因此，有效的治療

2、CPB-SIRS可以從適時適量的誘導(dǎo)PMN凋亡入手。但是，目前對CPB后凋亡的變化的研究較少，機制尚未清楚。 本研究通過動態(tài)觀察室間隔缺損修補術(shù)患兒在體外循環(huán)各時點靜脈血中PMN的凋亡率，及其Fas、Bcl-2凋亡調(diào)控蛋白表達的變化規(guī)律，探討CPB后PMN凋亡的變化及其分子生物學(xué)機制，為臨床從PMN凋亡調(diào)控入手防治CPB引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)提供實驗室依據(jù)。 方法：選擇擇期在體外循環(huán)下行室間隔缺損修補術(shù)的患兒30例(男13，

3、女17)，年齡1～5歲，體重10～20kg，術(shù)前NYHA心功能分級均在Ⅰ～Ⅱ級，采用大劑量芬太尼和低濃度異氟醚全身麻醉，維庫溴銨維持肌松。 體外循環(huán)前應(yīng)用3mg/kg肝素抗凝，全身肝素化后根據(jù)全血激活凝血時間(ACT)酌情追加，維持ACT>480s。CPB采用Sarns 8000型心肺機、兒童型膜式氧合器(國產(chǎn)希健-Ⅰ)、兒童型體外循環(huán)管道(科威)和兒童型動脈微栓過濾器(科威)進行體外轉(zhuǎn)流。根據(jù)術(shù)前血常規(guī)檢查結(jié)果，確定預(yù)充液的種

4、類和容量，多采用6％羥乙基淀粉(賀斯)、復(fù)方乳酸鈉林格氏液以及壓積紅細胞預(yù)充，并在CPB中使Hct維持在25％～30％，鼻咽溫27～31℃，灌流量按2.2～2.8L·min<'-1>·m<'-2>體表面積計算，灌注壓力維持在50～80mmHg。心肌保護采用冷晶體停跳液進行主動脈根部灌注。轉(zhuǎn)流中根據(jù)血氣分析結(jié)果調(diào)節(jié)電解質(zhì)。在撤離體外循環(huán)前，患兒鼻咽溫度升至36℃。停CPB后，按1：1的劑量用硫酸魚精蛋白中和肝素。術(shù)中均不用激素、抑肽酶、全

5、血及超濾。分別于麻醉誘導(dǎo)后CPB前(T<,0>)，CPB后30分鐘(T<,1>)，停CPB后30分鐘(T<,2>)，術(shù)后24小時(T<,3>)共4個時點采取靜脈血標本，采用Ficoll液密度梯度離心法分離中性粒細胞，瑞氏染色檢驗分離的細胞純度，臺盼蘭檢驗細胞活性。將PMN用70％酒精固定18h后，用含0.1％Triton-X100和RNaseA酶的碘化丙啶(PI)避光染色，用流式細胞儀觀察PMN凋亡率(AP％)。另外取各時點100μl全

6、血加入藻紅蛋白(PE)標記的Fas熒光單克隆抗體，溶血素裂解紅細胞的干擾，同時用鼠抗人PE標記IgG2aк作同型陰性對照，用流式細胞儀檢測陽性細胞百分數(shù)。檢測Bcl-2的表達時，將分離的PMN懸于含10％胎小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于5％CO<,2>，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，破膜后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Bcl-2熒光單克隆抗體，同時用鼠抗人FITC標記IgG2aк作同型陰性對照，流式細胞儀檢測陽性細胞百分數(shù)。

7、 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示。不同時點的數(shù)據(jù)進行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩變量間的相互關(guān)系用直線相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果： 1 體外循環(huán)轉(zhuǎn)流持續(xù)時間52±17分鐘，阻斷升主動脈時間28±11分鐘。所有病例均痊愈出院。 2 中性粒細胞凋亡率在CPB期間明顯降低，與T<,0>比較，在T<,2>時點達最低值(1.79±0.57％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

8、5)，T<,3>時點恢復(fù)到CPB前水平(P>0.05)。PMN凋亡率最低值與CPB持續(xù)時間呈負相關(guān)(r=-0.648，P<0.05)。 3與T<,0>比較，PMN膜上Fas的陽性細胞表達百分數(shù)在T<,2>、T<,3>時點降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與T<,2>比較，T<,3>時點數(shù)值開始上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Fas的陽性細胞表達百分數(shù)與PMN凋亡率最低值呈正相關(guān)(r=0.546，P<0.05)。

9、 4 與T<,0>比較，在T<,1>、T<,2>、T<,3>時點PMN胞內(nèi)Bcl-2的陽性細胞表達百分數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Bcl-2的陽性細胞表達百分數(shù)與PMN凋亡率最低值呈負相關(guān)(r=-0.569，P<0.05)。 結(jié)論： 1.CPB觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)的過程中可導(dǎo)致中性粒細胞生存環(huán)境發(fā)生變化，產(chǎn)生的多種凋亡抑制因素使PMN凋亡受到抑制，從而PMN生存周期延長，PMN數(shù)目增加。 2.Fas