芥藍蘿卜硫苷生物合成主要基因表達特性及功能鑒定.pdf

1、芥藍（Brassica oleraceavar.alboglabraBailey），屬于蕓薹屬，廣泛分布于中國華南地區(qū)、臺灣、日本及東南亞。芥藍具有很高的營養(yǎng)價值，含有豐富的維生素C、硫苷、類胡蘿卜素和酚類化合物等。硫代葡萄糖苷，簡稱硫苷，是植物中富含氮和硫的次生代謝物。硫苷及其衍生產(chǎn)物（異硫氰酸鹽、硫氰酸脂和腈類），在植物防御反應(yīng)、特殊風味形成和抗癌等方面具有特殊作用。根據(jù)側(cè)鏈R的氨基酸來源不同，可以將硫苷分為脂肪族、芳香族及吲哚族硫

2、苷。4-甲基亞磺酰丁基硫苷，又稱蘿卜硫苷，屬于脂肪族硫苷，其降解產(chǎn)物為蘿卜硫素。蘿卜硫苷是十字花科植物中的重要次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗氧化和抑菌活性。
　　本研究以不同蘿卜硫苷含量的芥藍為材料，克隆了3個蘿卜硫苷生物合成結(jié)構(gòu)基因BCAT4、MAM1、CYP79F1和3個調(diào)控基因MYB28、MYB29和MYB76的全長序列，進行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并分析基因表達模式。另外，構(gòu)建MYB28的超表達和RNAi載體，通過花藥浸染

3、法導(dǎo)入擬南芥以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入芥藍，并測定轉(zhuǎn)基因植株的基因表達水平和硫苷含量。本研究為通過基因工程手段提高芥藍蘿卜硫苷含量奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　?。?）從芥藍中分別克隆到結(jié)構(gòu)基因BCAT4（Genbank登錄號：KP295464）、MAM1（Genbank登錄號：KP295465）、CYP79F1（Genbank登錄號：KP295466）和調(diào)控基因MYB28（Genbank登錄號：KP723785）、MYB2

4、9（Genbank登錄號：KP723786）和MYB76（Genbank登錄號：KP723787）。序列分析表明，BCAT4的cDNA全長序列1394bp，5'非翻譯區(qū)42bp，最大開放閱讀框1143bp，3'非翻譯區(qū)209bp，編碼380個氨基酸，編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為42kDa，等電點為9.09。MAM1的cDNA全長序列1560bp，5'非翻譯區(qū)291bp，最大開放閱讀框1164bp，3'非翻譯區(qū)105bp，編碼387個氨基酸

5、，編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為42kDa，等電點為5.99。CYP79F1的cDNA全長序列1685bp，5'非翻譯區(qū)27bp，最大開放閱讀框1626bp，3'非翻譯區(qū)32bp，編碼541個氨基酸，編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為61kDa，等電點為8.26。MYB28的cDNA全長序列1257bp，5'非翻譯區(qū)138bp，最大開放閱讀框1020bp，3'非翻譯區(qū)99bp，編碼339個氨基酸，編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為38kDa，等電點為6.8

6、7。MYB29的cDNA全長序列1081bp，5'非翻譯區(qū)24bp，最大開放閱讀框966bp，3'非翻譯區(qū)91bp，編碼321個氨基酸，編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為84kDa，等電點為5.07。MYB76的cDNA全長序列1066bp，5'非翻譯區(qū)23bp，最大開放閱讀框1017bp，3'非翻譯區(qū)26bp，編碼338個氨基酸，編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為88kDa，等電點為5.06。
　　（2）運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

7、技術(shù)分析了芥藍蘿卜硫苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因（BCAT4、MAM1、CYP79F1）和調(diào)控基因（MYB28、MYB29和MYB76）在不同品種芥藍和芥藍不同部位以及不同發(fā)育時期的表達水平。結(jié)果表明，芥藍蘿卜硫苷合成相關(guān)基因具有組織表達特異性，主要在子葉、葉片和莖中表達，子葉、葉片和莖中基因表達量高于花和種子。芥藍蘿卜硫苷合成相關(guān)基因在葉片不同發(fā)育時期的表達量不同，主要在成熟葉中表達，成熟葉的基因表達量高于幼葉。芥藍蘿卜硫苷合成相關(guān)基因表達水平

8、與其相應(yīng)的蘿卜硫苷含量一致。成熟前期（蘿卜硫苷含量低）的BCAT4、MAM1和MYB28表達量高于商品成熟后期（蘿卜硫苷含量高），而成熟前期的CYP79F1、MYB29和MYB76表達量則低于商品成熟后期。
　?。?）根據(jù)芥藍蘿卜硫苷合成基因MYB28的cDNA序列設(shè)計特異引物，經(jīng)PCR擴增，得到約1200 bp目的片段，將目的片段連接到T載體上，用BamHI和SmaI雙酶切，回收小片段，再和回收到的pFGC5941載體片段轉(zhuǎn)化大

9、腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，用BamHI和SmaI雙酶切檢測，然后利用凍融法，把構(gòu)建好的超表達載體轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105中保存。同時，根據(jù)芥藍蘿卜硫苷合成基因MYB28的cDNA序列設(shè)計特異引物擴增出270bp的干擾片段，按照相反方向分別連接到pFGC5941載體上，成功構(gòu)建了RNAi表達載體。
　?。?）通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將載體導(dǎo)入芥藍。PCR和Southern雜交檢測結(jié)果表明MY