鹽芥EST庫中某未知基因的功能鑒定.pdf

1、本文目的在于研究模式植物鹽芥EST庫中某未知基因的生物學(xué)功能，因此將多種鑒定方法用于同一基因的功能的研究。通過多種方法，研究了鹽芥EST庫中某未知基因的功能，并推測該基因在鹽芥耐鹽機(jī)制中的作用。 在200mM的NaCl處理的45日齡小鹽芥(山東東營)地上部分構(gòu)建的λZap-cDNA文庫(EST文庫)中，篩選到的第100(B1698705)號序列是一個(gè)未知蛋白，我們命名為NOVEL蛋白。通過對其序列特征、基因結(jié)構(gòu)的分析得知該蛋白

2、基因全長序列為474bp,編碼158個(gè)氨基酸(158AA，大約18KD)。該未知蛋白在該EST庫中相比于對照表達(dá)豐度較高，并且在大約1580個(gè)標(biāo)簽中該基因檢測到六個(gè)，均為表達(dá)豐度較高的基因。通過軟件分析描述該蛋白可能定位于核內(nèi)。該蛋白分子較小，推測該蛋白可能具有NaCL誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的特性，將重點(diǎn)研究其功能與作用。 Northern-Blotting分析表明小鹽芥在200mmol/LNaCl處理不同時(shí)間下的該基因在鹽芥地上

3、部分表達(dá)量明顯高于對照，隨時(shí)間的延長該基因在鹽芥地上部分中的表達(dá)量會(huì)增加，48hr達(dá)到最高；用不同濃度的NaCl處理鹽芥24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同濃度NaCl處理后該基因在鹽芥地上部分的表達(dá)量也有所升高，其中在150mMNaCl處理下轉(zhuǎn)錄水平最高，而在200mMNaCl處理下轉(zhuǎn)錄水平又開始略微下降；該基因在4℃低溫處理下的表達(dá)量顯著提高，3小時(shí)其表達(dá)量達(dá)最高，隨著處理時(shí)間的延長Novel基因的表達(dá)量又逐漸降低；該基因在40℃高溫處理下表達(dá)量變化

4、趨勢不明顯。 該基因在鹽芥中的沉默株系中，在NaCL(200mmol/L)及長期(45天)冷(4℃)處理下并未見較明顯表現(xiàn)型；該基因在擬南芥中的過量表達(dá)株系，進(jìn)行了多組處理。 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長45天后，用200mMNaCl處理24小時(shí)，處理中轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況均好于野生型；在氧化脅迫處理實(shí)驗(yàn)中，0.5μM甲基紫精(MethylViologenMV)處理對于擬南芥野生型的傷害作用更大；2μMABA(脫落酸)處

5、理的生長形勢來看，對于野生型來說，發(fā)芽率以及生長情況都不及轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)型，直觀看到該轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)擬南芥的抗鹽性有所提高。 實(shí)驗(yàn)又構(gòu)建了原核表達(dá)體系，在體外表達(dá)純化該基因編碼的蛋白，用于制備抗體。但由于抗體制備過程中抗原純化的困難，使得抗體特異性不高，無法進(jìn)行進(jìn)一步的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。 又進(jìn)行了該基因編碼蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位實(shí)驗(yàn)，采用綠色熒光蛋白載體pPK100構(gòu)建了NOVEL-GFP融合蛋白表達(dá)載體，并在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)