羊膜接觸鏡的研制及其在兔角膜上皮損傷修復中的應用.pdf

1、目的：利用PMMA環(huán)研制新型羊膜接觸鏡，探討其在不同程度兔角膜上皮損傷修復中的應用效果。 方法: 羊膜接觸鏡的制備方法及其在兔中央角膜上皮損傷修復中的應用PMMA環(huán)根據兔眼結膜囊的印模磨制。16只兔左眼均去除中央10mm角膜上皮，隨機分為兩組，實驗組羊膜片用PMMA環(huán)和纖維蛋白膠固定：PMMA環(huán)包裹在羊膜中，塞入結膜囊后，折疊的羊膜之間及羊膜與PMMA環(huán)之間注入纖維蛋白膠以加固羊膜的支撐作用，但是纖維蛋白膠不用來粘附眼表

2、的任何部位。對照組羊膜用10-0尼龍縫線間斷縫合。術后裂隙燈顯微鏡觀察7天，記錄上皮愈合情況及并發(fā)癥，計數每種并發(fā)癥的兔只數，T-test比較兩組之間的差異。羊膜接觸鏡聯合角膜緣干細胞移植在兔角膜緣損傷修復中的應用制備兔角膜緣及角膜上皮損傷模型，培養(yǎng)角膜緣上皮細胞，消化收集后接種于Matrigel包被的培養(yǎng)皿中貼壁20分鐘，收集貼壁的細胞(2X105個/眼)注射到羊膜接觸鏡與損傷的眼表之間(n=8)，并在體外檢測細胞形成復層的能力。術后

3、24小時后更換羊膜，如果熒光素呈彌漫性染色，則重復細胞注射，對照組不注射細胞，僅植入羊膜接觸鏡(n=8)，空白對照組損傷后不做處理，裂隙燈照相隨訪2周，計數角膜上皮合、角膜感染、新生血管、角膜上皮缺損的兔只數，單因素方差分析比較兩兩之間的差異。 結果: 羊膜接觸鏡的在兔中央角膜上皮損傷修復中的應用兩組中的兔角膜上皮均在5天后愈合，兩組間角膜上皮愈合時間、周邊角膜新生血管均無顯著性差別。在無縫線組，所有的羊膜在隨訪期間保持

4、完整，1只兔結膜由于暴露于PMMA環(huán)而出現部分上皮缺損，在對照組，觀察到50％以上的兔實驗眼出現結膜水腫，縫線松脫，植片脫落，點狀出血，和部分結膜上皮缺損(各種并發(fā)癥的兔只數在兩組間的差別P<0.05)。 羊膜接觸鏡聯合角膜緣干細胞移植在兔角膜緣損傷修復中的應用免疫組化染色顯示20分鐘內貼壁的角膜緣細胞Ki67(+)，integrinα6(+)，integrinβ1(+)，P63(+)，少數細胞K3/K12陽性，且細胞可在氣-液

5、界面培養(yǎng)1周后形成復層結構，HE染色可見細胞排列模式接近正常角膜上皮組織，電鏡下可見微絨毛、緊密連接等超微結構。20分鐘后貼壁的細胞呈Cx43(+)，K3/K12陽性，細胞移植后第14天，實驗組6/8只兔眼表上皮得以重建，羊膜組每只兔出現不同程度的結膜化表現或新生血管，1只兔角膜上皮愈合不良，空白對照組表現為3只兔感染、5只兔角膜上皮缺損，均表現為周邊角膜新生血管、愈合不良，感染等。單因素方差分析結果顯示A組和B損傷愈合均優(yōu)于空白組(P

6、<0.05)，A組新生血管少于B組和C組(P<0.05)，B組與C組之間新生血管沒有差異，但是C組愈合不良、感染顯著高于B組。免疫組化染色顯示實驗組角膜區(qū)域上皮K3/K12(+)、Occludin(+)、integrinα6(+)、MUC5AC(-)，表明是角膜上皮表型，而對照組角膜上皮MUC5AC(+)、K3/K12(-)，為結膜上皮表型。 結論: 羊膜接觸鏡在兔中央角膜上皮損傷修復中的應用利用PMMA環(huán)聯合纖維蛋白膠

7、在眼表固定羊膜的并發(fā)癥遠遠少于傳統的間斷縫合法，這種羊膜接觸鏡固定技術可避免縫線所固有的并發(fā)癥，減輕病人痛苦、大大節(jié)省手術時間，在修復中央角膜缺損時可以替代傳統縫線固定技術。羊膜接觸鏡聯合角膜緣干細胞移植在兔角膜緣損傷修復中的應用羊膜接觸鏡聯合角膜緣干細胞移植可以用于角膜緣損傷后的上皮再生修復，這種基于單細胞的眼表重建技術可以避開角膜上皮組織重建、收集中的技術難題，并節(jié)省組織構建所需的時間，PMMA環(huán)-羊膜接觸鏡與組織工程技術的結合是我