APC蛋白、GSK3β在吸煙小鼠氣道上皮損傷修復(fù)中的動(dòng)態(tài)變化.pdf

1、吸煙是呼吸系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)因素，是引起慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)的主要原因。氣道(氣管和支氣管)上皮作為抵御外來?yè)p傷因素的第一道防線，吸入香煙煙霧可以造成其損傷。在修復(fù)過程中，損傷周圍的上皮細(xì)胞(airwayepithelialcell，AEC)分裂增殖、分化和遷移，以重新覆蓋受損傷區(qū)域，這一系列細(xì)胞活動(dòng)過程均有賴于微管及其相關(guān)蛋白之間復(fù)雜的相互作用。近年來研究顯示，腺

2、瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatouspolyposiscoli，APC)蛋白可以通過其分子羧基末端的微管結(jié)合區(qū)域與微管正極直接結(jié)合，故被稱為微管正極示蹤蛋白(plus-endtrackingproteins)，它以微管連接蛋白的形式，調(diào)節(jié)微管組裝、引發(fā)微管成束以及增加微管穩(wěn)定性，被視為一種新的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associatedprotein，MAPs)，積極促進(jìn)修復(fù)中細(xì)胞活動(dòng)的進(jìn)行。糖原合成酶激酶3β(glyc

3、ogensynthasekinase3β，GSK3β)是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有廣泛的作用底物，參與多種細(xì)胞生命過程。APC蛋白作為GSK3β的底物之一，被GSK3β磷酸化之后與微管的結(jié)合減少，導(dǎo)致微管解聚；GSK3β還能夠磷酸化其它多種微管相關(guān)蛋白，減弱它們穩(wěn)定微管的能力，進(jìn)而影響損傷修復(fù)中細(xì)胞遷移等細(xì)胞活動(dòng)；GSK3β活性也受其它激酶的磷酸化調(diào)節(jié)，引起活性抑制?；谝陨腺Y料，我們推測(cè)APC蛋白、GSK3β可能參與修復(fù)過程

4、中的細(xì)胞遷移、分裂增殖等活動(dòng)，從而在氣道上皮損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。 目的：本研究通過建立小鼠吸煙的動(dòng)物模型，檢測(cè)APC蛋白、GSK3β在氣道上皮不同損傷修復(fù)時(shí)期中的動(dòng)態(tài)變化，初步探討二者在吸煙致氣道上皮損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制，繼而為進(jìn)一步深入探討氣道上皮損傷后的修復(fù)機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)用相同濃度(每次燃燒8支卷煙，每支10min，換煙時(shí)，停止吸煙5min，每次2h，每天1次，每周7次)的香煙主流煙霧分

5、別使小鼠吸入1周、4周、8周和12周，建立吸煙致氣道上皮損傷修復(fù)的動(dòng)物模型，以未吸煙小鼠作為對(duì)照。采用HE染色觀察損傷修復(fù)過程中氣道上皮的形態(tài)學(xué)特征；免疫組織化學(xué)檢測(cè)APC蛋白、GSK3β在氣道上皮的表達(dá)變化；Western印跡技術(shù)檢測(cè)肺組織中APC蛋白、GSK3β以及磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的總表達(dá)量；免疫熒光共聚焦成像觀察APC蛋白、GSK3β在氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的分布變化。 結(jié)果：①HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組氣道粘膜上

6、皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，細(xì)胞間連接緊密；吸煙1w氣道上皮細(xì)胞纖毛減少、倒伏，細(xì)胞間連接疏松，細(xì)支氣管壁有少數(shù)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；吸煙4w氣道上皮細(xì)胞壞死、脫落，多數(shù)上皮細(xì)胞問連接松散，氣道上皮完整性部分被破壞，細(xì)支氣管壁有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)；吸煙8w氣道上皮細(xì)胞排列整齊、纖毛減少，上皮細(xì)胞之間連接未見明顯異常；吸煙12w損傷情況與吸煙4w相似，但伴有局灶性氣道粘膜基底層細(xì)胞增生，細(xì)胞層次增多。②免疫組化染色結(jié)果：APC蛋白在吸煙1w時(shí)細(xì)支氣管上皮

7、細(xì)胞的表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)(P＜0.05)，吸煙4w時(shí)APC蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，吸煙8w、12w時(shí)APC蛋白表達(dá)均較吸煙4w增強(qiáng)(P＜0.05)但與對(duì)照組比較無顯著性差異；GSK3β在吸煙組各階段細(xì)支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均較對(duì)照組減弱(P＜0.01或P＜0.05)，吸煙8w時(shí)GSK3β表達(dá)較吸煙1w時(shí)增強(qiáng)(P＜0.01)。③Western印跡顯示：APC蛋白、GSK3β在各實(shí)驗(yàn)組肺組織的含量變化與免疫組化表達(dá)結(jié)果一致；吸

8、煙組各階段GSK3β磷酸化水平均高于對(duì)照組，以吸煙1w時(shí)表達(dá)最高。④熒光共聚焦成像顯示：APC蛋白紅色熒光顆粒在對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈均勻彌散分布，吸煙1w、8w時(shí)，紅色熒光顆粒在氣道上皮細(xì)胞腔面和側(cè)面質(zhì)膜下聚集成簇狀，吸煙4w時(shí)紅色熒光強(qiáng)度減弱，吸煙12w時(shí)熒光顆粒分布與對(duì)照組相似；GSK3β在對(duì)照組和吸煙組氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)都呈均勻彌散分布，無定位改變。 結(jié)論：①吸煙對(duì)氣道上皮存在持續(xù)性的損害作用，同時(shí)也存在機(jī)體對(duì)其損傷