熒光定量PCR聯(lián)合檢測急性白血病患者ERG和MN1基因的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、急性白血病（AL）是我國的十大惡性腫瘤之一，也是青少年發(fā)病率最高的惡性腫瘤。AL包括急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和急性髓細(xì)胞白血病（AML）。AL的發(fā)生是由于骨髓中異常的白血病細(xì)胞大量的增殖并不斷侵犯機(jī)體各個(gè)器官、組織，使得正常造血功能受到抑制，從而引起臨床常見的感染、出血、貧血等癥狀[2]。AL一旦發(fā)生，病情危重，進(jìn)展迅猛，死亡率高。近年來由于環(huán)境污染等因素，AL的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。隨著新的化療藥物的應(yīng)用、化療方案的改進(jìn)、支持治療

2、的加強(qiáng)及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用，AL的治療效果已有明顯改善，75%左右的AML患者經(jīng)化療后可獲完全緩解（CR），但仍有20%～30%AL病人經(jīng)常規(guī)化療方案不能獲得CR，稱為難治性AL。此外，50%左右的CR病人還會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。而一旦出現(xiàn)難治和復(fù)發(fā)，再次緩解率低，預(yù)后差。因此，難治和復(fù)發(fā)是目前導(dǎo)致AL治療失敗的最根本原因。 目前所制定難治復(fù)發(fā)白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)均為臨床治療后的回顧性診斷，無法運(yùn)用于指導(dǎo)臨床分層治療。如果能夠建立起

3、一套難治復(fù)發(fā)白血病早期診斷的方法，不僅可以早期預(yù)測難治復(fù)發(fā)，判斷病人的預(yù)后；而且更重要的是能夠指導(dǎo)臨床治療，對(duì)高危病人應(yīng)改變常規(guī)的治療模式，采用更積極的個(gè)體化治療，如更早地選擇異基因造血干細(xì)胞移植等，從而減少難治復(fù)發(fā)白血病發(fā)生率、提高AL治療緩解率和長期生存率，具有十分重要的意義。 目前研究發(fā)現(xiàn)某些基因的異常與白血病發(fā)生及發(fā)展（難治復(fù)發(fā)）存在密切關(guān)系，如AML的FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（FLT3/ITD）突變和ALL的bcr/abl

4、融合基因的表達(dá)。目前已證實(shí)20%～30%AML和ALL病人分別存在FLT3/ITD突變和bcr/abl融合基因的表達(dá)，而具有FLT3/ITD突變AML和bcr/abl陽性ALL易出現(xiàn)難治復(fù)發(fā)，預(yù)后差，可作為早期診斷難治復(fù)發(fā)的分子指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。但70%～80%AML和ALL不存在FLT3/ITD突變和bcr/abl融合基因，且目前尚缺乏同時(shí)在ALL和AML均有異常表達(dá)并與預(yù)后相關(guān)的基因異常。因此，尋找新的與難治復(fù)發(fā)AL相關(guān)的基因異常

5、用于指導(dǎo)臨床分層治療顯得十分迫切。最新研究提示ERG基因及MN1基因在AL患者中過度表達(dá)，且可能與難治復(fù)發(fā)AL相關(guān)。 ERG基因[V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog（avian）]位于21q22，是ETS癌基因家族的一員，ETS轉(zhuǎn)錄因子是系特異性的調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞定型、分化的關(guān)鍵分子，而ERG在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞早期成熟過程中起重要作用。在早期T、B淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞中都可

6、檢測到ERG特異性的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)ERG過度表達(dá)常見于有復(fù)雜核型和21染色體異常的AML患者中，ERG基因在造血干細(xì)胞，原始巨核細(xì)胞系，唐氏綜合癥患者的白血病細(xì)胞內(nèi)也可出現(xiàn)表達(dá)。ERG基因在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程中起關(guān)鍵作用，目前發(fā)現(xiàn)ERG基因可以在AML與ALL患者均可出現(xiàn)異常表達(dá)并可能與預(yù)后相關(guān)。 MN1基因[meningioma（disrupted in balanced translocation）1]起初被發(fā)現(xiàn)是

7、腦膜瘤患者t（4；22）的一個(gè)靶基因，盡管MN1與腦膜瘤之間的關(guān)系仍然未明，但是它被認(rèn)為是22染色體上主要的腦膜瘤腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)MN1可在原始造血細(xì)胞及ALL患者中出現(xiàn)異常高表達(dá)，提示MN1在白血病形成過程中起重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道MN1是造血過程中獨(dú)立的致癌基因，可能通過促進(jìn)增殖及抑制分化而誘發(fā)白血病。目前發(fā)現(xiàn)大多數(shù)AML及ALL患者均可以發(fā)現(xiàn)MN1基因的異常表達(dá)，但不同AL患者中其表達(dá)水平存在較大差異。國外最新研究發(fā)現(xiàn)，MN1的

8、過度表達(dá)是AML獨(dú)立的預(yù)后因素。MN1高表達(dá)者其誘導(dǎo)緩解療程第15天對(duì)化療的反應(yīng)顯著差于低表達(dá)組，且其無復(fù)發(fā)生存率（RFS）和總生存時(shí)間（OS）也明顯縮短。 目前發(fā)現(xiàn)MN1和ERG基因的表達(dá)水平與AL的預(yù)后存在一定關(guān)系，且考慮到兩者在AL發(fā)生、發(fā)展中的作用及其在不同AL患者中的表達(dá)水平的差異。有必要深入研究MN1和ERG基因在AL（包括ALL和AML）患者中的表達(dá)水平、明確兩者的相關(guān)性及其與臨床療效和預(yù)后的關(guān)系，探討聯(lián)合定量檢測

9、MN1和ERG基因的表達(dá)水平在早期診斷難治AL及預(yù)后判斷中的價(jià)值。在本研究中，我們構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ERG和MN1基因mRNA表達(dá)量的方法，并檢測87例初發(fā)AML患者、80例初發(fā)ALL患者及16例非惡性血液病者ERG和MN1 mRNA的表達(dá)水平，并對(duì)其與細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)，免疫表型、臨床特征、臨床療效及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了分析。 目的： 1.構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ERG和MN1基因的方法； 2.檢測

10、初治AL患者（包括AML和ALL）中ERG和MN1基因的表達(dá)水平及不同F(xiàn)AB亞型患者中兩基因表達(dá)水平的差異。 3.探討AL不同染色體核型、臨床特征及免疫表型與ERG和MN1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系； 4.分析ERG基因和MN1基因兩者表達(dá)水平之間的關(guān)系及其與AL療效和預(yù)后的關(guān)系。 方法： 1.培養(yǎng)KASUMI-1細(xì)胞，提取總RNA，選用GAPDH為內(nèi)參基因，針對(duì)ERG、MN1及GAPDH mRNA設(shè)計(jì)引物

11、，RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)片斷，PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化到T載體，構(gòu)建含目標(biāo)片段的質(zhì)粒，做為陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板的克隆。 2.克隆的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板按106，105，104，103，102，101copies/μl梯度稀釋，在熒光定量PCR儀分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線并驗(yàn)證該方法的靈敏性和重復(fù)性，同時(shí)驗(yàn)證ERG、MN1、GAPDH三者擴(kuò)增效率是否一致。 3.研究對(duì)象：經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型確診的87例

12、初治AML患者及80例初治ALL患者。16名非惡性血液疾病患者骨髓標(biāo)本為試驗(yàn)對(duì)照組，其中特發(fā)性血小板紫癜患者9名，缺鐵性貧血患者7名。 4.提取AL及對(duì)照組患者骨髓標(biāo)本，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。每份標(biāo)本均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)檢測，最后CT值取其均數(shù)。為排除RNA濃度對(duì)擴(kuò)增效率的影響，ERG和MN1 mRNA表達(dá)水平采用的相對(duì)表達(dá)量來表示，即采用2-△CT值（△CT=ERG/MN1-GAPDH；2-△CT

13、=2GAPDH-ERG/MN1）來表示ERG和MN1的相對(duì)表達(dá)量，并分析ERG和MN1表達(dá)水平與FAB分型、核型、免疫表型、臨床特征、療效和預(yù)后關(guān)系。 5.利用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。兩組計(jì)量資料間分布比較用Mann-whitney U test；兩組以上計(jì)量資料間分布比較用Kruskal-wallis test及Bonferroni test；兩變量間相關(guān)分析采用Spearman rank correlation t

14、est；率的比較采用卡方檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan Meier analyses，不同生存曲線間差異采用log-rank test。生存時(shí)間的單因素和多因素分析使用Cox Regression。所有檢驗(yàn)以P<0.05為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雙側(cè)檢驗(yàn)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了熒光定量PCR檢測ERG和MN1 mRNA表達(dá)水平的方法。 2.AML患者ERG和MN1基因表達(dá)水平顯著高于非惡性血液病患者，AML中ERG基因

15、表達(dá)水平與MN1基因表達(dá)水平未存在相關(guān)性。ALL患者ERG基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而ALL患者M(jìn)N1基因表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.AML患者ERG基因的表達(dá)水平與WBC及血清LDH水平存在正相關(guān)，高危染色體核型患者中ERG的表達(dá)水平顯著高于低中危組；AML患者ERG基因的表達(dá)水平與FAB亞型及CD34、CD56、CD117抗原是否表達(dá)無相關(guān)性。AML患者M(jìn)N1基因表達(dá)水平與FAB亞型、血象、臨床特征、免疫表

16、型及染色體危險(xiǎn)度分層之間均無相關(guān)性。ALL中ERG基因表達(dá)的水平與血象、LDH水平、BCR/ABL及是否伴髓系抗原表達(dá)均無相關(guān)性。 4.AML中ERG基因高表達(dá)組一年復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)組、一年OS顯著縮短，是AML預(yù)后不良的指標(biāo)，但ERG基因表達(dá)水平對(duì)初治AML患者CR率無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)顯示MN1基因表達(dá)水平對(duì)AML的CR率、一年復(fù)發(fā)率及OS無顯著影響。ALL中ERG基因高表達(dá)組一年OS顯著縮短，但與CR率及一年復(fù)發(fā)率無顯著