委陵菜黃酮衍生物抗糖尿病活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 建立人HepG2肝細(xì)胞及由小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞株誘導(dǎo)而成的成熟脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗模型，篩選委陵菜黃酮衍生物抗糖尿病活性，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。
　　 方法:
　　 1、胰島素抵抗模型的建立:
　　 HepG2人肝細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗模型是研究胰島素抵抗中最為常用的兩類細(xì)胞模型，采用文獻(xiàn)方法對(duì)胰島素抵抗模型進(jìn)行復(fù)制，以葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法（GOD—POD

2、法）檢測細(xì)胞中葡萄糖的消耗量確立兩種細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立。
　　 2、抗糖尿病活性篩選:
　　 委陵菜黃酮為中藥委陵菜抗糖尿病活性的主要成分，為進(jìn)一步提高其生物活性，發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物，課題組前期設(shè)計(jì)合成了一系列委陵菜黃酮衍生物，本文分別以胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞為篩選模型，通過葡萄糖氧化酶法檢測各衍生物對(duì)模型細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響，評(píng)價(jià)各衍生物的抗糖尿病活性。
　　 3、抗糖尿病作用機(jī)制

3、研究:
　　 以篩選出的抗糖尿病活性最強(qiáng)委陵菜黃酮衍生物5f分別與HepG2細(xì)胞和3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞共孵育，Western blot方法檢測Comp.5f對(duì)5'-AMP激活蛋白激酶(AMPK)，乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC），以及蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)磷酸化水平的影響。檢測Comp.5f對(duì)HepG2細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(GLUT2)及3T3-L1成熟

4、脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)采用高濃度胰島素(5×10-7mol/l)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，以1μmol/l的地塞米松作用4天誘導(dǎo)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，應(yīng)用葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法（GOD—POD法）檢測各組細(xì)胞上清液中葡萄糖含量，與正常細(xì)胞相比，具有顯著差異(p＜0.05)，確定胰島素抵抗細(xì)胞模型的成功建立。
　　 2、抗糖尿病活

5、性篩選結(jié)果顯示除化合物7b外，各衍生物均具有提高胰島素抵抗模型細(xì)胞葡萄糖消耗量的作用，化合物5b、5e、5g和10b的活性較強(qiáng)，與市售藥物二甲雙胍相當(dāng)，化合物5f、7d、10c抗糖尿病活性最強(qiáng)，優(yōu)于市售藥物二甲雙胍。
　　 委陵菜黃酮衍生物5a、5g、5f、5e、7d作用于胰島素抵抗的HepG2及3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞模型，以委陵菜黃酮衍生物5f抗糖尿病活性最強(qiáng)，委陵菜黃酮衍生物5f可在一定程度上提高3T3-L1脂肪細(xì)胞的2-

6、脫氧-[3H]-葡萄糖攝取量。
　　 3、委陵菜黃酮衍生物5f可上調(diào)HepG2肝細(xì)胞及3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK，ACC的磷酸化水平(p＜0.05)，而不影響Akt的磷酸化水平。以AMPK的特異性抑制劑Compound C與Comp.5f共同作用于HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示Compound C能夠顯著降低5f刺激的AMPK、ACC磷酸化水平的上調(diào)，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，Compound C僅能部分抑制黃酮衍生物5f刺激

7、的AMPK、ACC磷酸化水平的上調(diào)作用。Comp.5f對(duì)HepG2人肝細(xì)胞內(nèi)的GLUT2水平有一定的下調(diào)作用。Comp.5f對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)的GLUT4蛋白表達(dá)量沒有發(fā)生明顯影響。
　　 結(jié)論:
　　 本文建立了HepG2人肝細(xì)胞及3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗模型，觀察委陵菜黃酮衍生物對(duì)胰島素抵抗的影響，結(jié)果表明黃酮類化合物均具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性，活性最強(qiáng)的Comp.5f可顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞及3T3-L