中華鱉Foxl2基因克隆與表達(dá)及溫度和外源激素對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、在漫長(zhǎng)的生命進(jìn)化過程，性別的遺傳是高度保守的，但在基因型性別決定（Geneotypic sex determination，GSD）較為完善的生物類群演化出環(huán)境型性別決定（Environmental sex determination，ESD），它們?cè)谏鼩v程中的關(guān)系，對(duì)認(rèn)識(shí)生命演化規(guī)律具有重要意義。ESD類群的性別決定受溫度、激素的影響已被報(bào)道，在爬行動(dòng)物中，溫度決定后代性別現(xiàn)象十分普遍，性別相關(guān)基因更有可能被外源激素和溫度所干擾，而

2、關(guān)于中華鱉Foxl2基因此方面具體應(yīng)答變化還不清楚。
　　中華鱉（Pelodiscus sinensis）是一種被廣泛養(yǎng)殖的名特品種，隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科（Trionychidae）、鱉屬（Pelodiscus）。中華鱉雄性個(gè)體比雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度快近1/3，裙邊寬厚，膠質(zhì)含量高，深受市場(chǎng)歡迎，因此，在生產(chǎn)中孵化出更高比例的雄性個(gè)體對(duì)中華鱉養(yǎng)殖業(yè)具有非常重要的意義，本實(shí)驗(yàn)對(duì)中華鱉性別決定分子機(jī)制的研究可為其打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

3、
　　Foxl2（winged helix/forkhead transcription factor gene2）屬翼狀螺旋/叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族，已在多種物種獲得其基因序列，被認(rèn)為主要參與與卵巢早期發(fā)育、分化以及成體卵巢功能的維持，屬于雌性相關(guān)基因，而關(guān)于中華鱉尚未見到相應(yīng)的報(bào)道。
　　為中華鱉性別決定分子機(jī)制的研究提供生物學(xué)資料，本實(shí)驗(yàn)采用克隆、表達(dá)和定量RT-PCR等技術(shù)對(duì)Foxl2基因的序列特征、不同發(fā)育時(shí)期時(shí)空表達(dá)以

4、及溫度和外源激素對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果如下：
　　1、Foxl2基因的生物信息學(xué)分析
　　通過RT-PCR方法獲得 Foxl2基因中間cDNA序列（Gen Bank Accession No.KP734210），中華鱉Foxl2 cDNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)為903 bp，開放閱讀框編碼300個(gè)氨基酸，包括 DNA結(jié)合域（Fork-head(FH)-domain）；將中華鱉 Foxl2氨基酸序列與其它物種進(jìn)行同

5、源性比對(duì)，結(jié)果顯示脊椎動(dòng)物Foxl2 FH結(jié)構(gòu)域高度保守；根據(jù)NCBI網(wǎng)站的BLASTP進(jìn)行氨基酸序列分析，中華鱉與龜鱉類同源性最近，尤其與紅耳龜，構(gòu)建各物種Foxl2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果則顯示中華鱉與西部錦龜遺傳距離最近；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華鱉Foxl2基因和其它非哺乳動(dòng)物一樣缺少14個(gè)丙氨酸組成的聚丙氨酸區(qū)和甘氨酸-脯氨酸重復(fù)區(qū)。
　　2、中華鱉Foxl2基因克隆和組織表達(dá)研究
　　RT-PCR結(jié)果顯示Foxl2基因在

6、卵巢組織強(qiáng)烈表達(dá)，其次在腦、脾臟、眼睛、腎臟、肌肉、肝臟、心臟等組織也有一定程度表達(dá)；此外精巢也有微弱表達(dá)，且顯著低于卵巢中的表達(dá)量，性腺的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性，表明中華鱉Foxl2基因與雌性性腺發(fā)育密切相關(guān)。
　　3、E2和MT對(duì)中華鱉Foxl2表達(dá)的影響
　　為了研究外源激素和Foxl2基因的關(guān)系，對(duì)中華鱉注射雌二醇（E2）和甲基睪酮（MT），并在6 h、12 h、24 h、48 h、7 d和14 d分別檢測(cè)雌雄個(gè)體

7、 Foxl2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示E2上調(diào)Foxl2表達(dá)；MT對(duì)Foxl2的表達(dá)沒有明顯差異.表明Foxl2的表達(dá)具有激素依賴性。
　　4、E2、MT和溫度對(duì)中華鱉胚胎發(fā)育階段Foxl2基因的表達(dá)探究
　　本實(shí)驗(yàn)研究了中華鱉在26.5℃和32℃條件下Foxl2表達(dá)規(guī)律。定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12 h以前Foxl2表達(dá)最高，隨著胚胎發(fā)育，其表達(dá)顯著降低，直至34 d，32℃組表達(dá)量明顯高于26.5℃表達(dá)量，F(xiàn)oxl2在32