EB病毒LMP1介導(dǎo)PKC調(diào)控Annexin A2絲氨酸磷酸化的分子機制研究.pdf

1、EB 病毒與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如伯基特淋巴瘤、霍杰金氏淋巴瘤，鼻咽癌、乳腺癌和胃癌等上皮性腫瘤。作為一個外界環(huán)境致病因子，對其基因組功能分析發(fā)現(xiàn)其編碼的潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)是一個重要的瘤蛋白。在LMP1的羧基末端存在三個功能性結(jié)構(gòu)域CTAR1、CTAR2和CTAR3，它們通過募集信號銜接分子TRAFs、TRADD和JAK3異常激活NFкB、AP-1和STAI、三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、通路。激活的轉(zhuǎn)錄因子NFкB、AP-1和STAT進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因EGFR、cyclin D1、MMP9、survivin等的表達(dá)和磷酸化。 PKC 是細(xì)胞內(nèi)一類非常重要的鈣、磷脂依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKC各同工酶的分布具有特殊性，并在細(xì)胞功能方面各自發(fā)揮著不同的作用。Annexin A2是Annexins這類鈣離子依賴性的蛋白家族中的一員，Annexin A2與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤細(xì)胞中均存

3、在Annexin A2蛋白表達(dá)和磷酸化水平的上調(diào)。在細(xì)胞內(nèi)，Annexin A2以36kD的單聚體形式和與p11結(jié)合形成Anx II<,2>/pll<,2> 94kD的四聚體形式存在。 PKC是除NFκB、JNK、JAK/STATs、MAPK和PI3K/Akt外，我們首次發(fā)現(xiàn)的可由LMP1介導(dǎo)的另外一個蛋白激酶。Annexin A2是PKC的下游效應(yīng)分子，其磷酸化是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要分子機制之一。在上皮來源的鼻咽癌細(xì)胞中，對LM

4、P1介導(dǎo)PKC調(diào)控Annexin A2絲氨酸磷酸化分子機制及其生物學(xué)功能的研究，有助于進(jìn)一步完善這條新的信號通路。為此我們確定了“EB病毒LMP1介導(dǎo)PKC調(diào)控Annexin A2絲氨酸磷酸化的分子機制研究”這一課題，采用LMP1陰性的CNE1和LMP1穩(wěn)定表達(dá)的CNE1-LMP1鼻咽癌細(xì)胞系為主要實驗材料。我們通過 PKC Kinase Activity Assay Kit(Non-Radioactive．Stressgen)特異檢測

5、經(jīng)過不同處理細(xì)胞的PKC激酶活性；同時使用抗絲氨酸抗體進(jìn)行IP-Western blotting，檢測細(xì)胞內(nèi)Annexin A2絲氨酸磷酸化水平的變化。使用PKC激活劑TPA、阻斷LMPI表達(dá)的脫氧核酶Dzl和PKC特異性活性抑制劑發(fā)現(xiàn)，PKC的活化狀態(tài)與AnnexinA2絲氨酸磷酸化狀態(tài)的變化趨勢一致，因此得出結(jié)論：LMP1確實可通過PKC調(diào)控Annexin A2絲氨酸磷酸化，進(jìn)一步確定了這條通路的存在。 PKC屬于“IP3、

6、DAG信號系統(tǒng)”，磷脂酰肌醇磷脂酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)是PKC的上游關(guān)鍵性激酶，PLC同功酶中以PLC-β和PLC-γ的功能最為重要。使用特異針對PLC-β和PLC-γ的激酶活性抑制劑U73122，并以結(jié)構(gòu)相似但無活性的小分子U73343和載體DMSO作為對照，研究PI-PLC激酶對PKC激酶和PKC下游效應(yīng)蛋白Annexin A2絲氨酸磷酸化水平的影響。

7、PI-PLC活性小分子抑制劑U73122能降低兩種細(xì)胞系的PKC激酶活性，進(jìn)而降低PKC下游蛋白Annexin A2的絲氨酸磷酸化水平。證實了LMPI介導(dǎo)PI-PLC調(diào)控PKC激酶活性和Annexin A2絲氨酸磷酸化水平。 前期實驗通過使用特異針對PKC α和PKCβ的抑制劑，證實了LMP1可能主要通過PKC α和PKC β調(diào)控Annexin A2絲氨酸磷酸化。我們進(jìn)一步研究PKC亞型對Annexin A2絲氨酸磷酸化的調(diào)控機

8、制。通過免疫共沉淀結(jié)合Western-Blotting，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)PKC α和PKCβ均可直接與Annexin A2結(jié)合；而且LMP1對PKCα、PKCβ的激酶活性都有上調(diào)的作用，但以對PKCβ的調(diào)控更顯著。 繼而我們在CNE1和CNE1-LMP1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PKCα、PKCβ特異性shRNA質(zhì)粒，特異且有效地阻斷PKCα、PKCβ的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞系中PKCα shRNA和PKCβ shRNA質(zhì)粒均能有效降低p-ser

9、-Annexin A2水平，證實在CNE1和CNE1-LMP1細(xì)胞內(nèi)PKCα和PKCβ兩種亞型均調(diào)控Annexin A2的絲氨酸磷酸化。進(jìn)一步我們進(jìn)行了重組活性激酶PKC和純化的GST-annexin A2之間的體外蛋白激酶反應(yīng)。結(jié)果表明，活性PKCα、PKC βⅠ、PKCβⅡ均可絲氨酸磷酸化Annexin A2，從而在細(xì)胞外水平提供了PKCα、PKC βⅠ和PKCβⅡ使Annexin A2絲氨酸磷酸化的新證據(jù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LMP1

10、調(diào)節(jié)Annexin A2絲氨酸磷酸化而移位入核。在Annexin A2的氨基末端包含有體內(nèi)外證實的PKC調(diào)節(jié)的絲氨酸磷酸化位點Ser25和體外證實的絲氨酸磷酸化位點Ser11。確定了在CNE1和CNE1-LMP1細(xì)胞中，PKC α、PKCβ均可調(diào)控Annexin A2的絲氨酸磷酸化后，我們構(gòu)建了pEGFP-AnxII野生型表達(dá)質(zhì)粒和三個突變質(zhì)粒(分別將Ser11、Ser25、Ser11和Ser25均突變成谷氨酸)，以進(jìn)一步確定Annex

11、in A2的具體絲氨酸位點的磷酸化對其入核的影響。通過免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)Annexin A2絲氨酸25位的磷酸化影響其入核。進(jìn)一步通過胞漿胞核分開抽提Western-Blotting，定量檢測野生型和三種突變質(zhì)粒表達(dá)蛋白的細(xì)胞分布予以了證實。 前期實驗已經(jīng)表明PKCα shRNA、PKCβ shRNA質(zhì)粒特異降低PKCα、PKCβ的蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)一步降低p-ser-Annexin A2水平，而且只有pEGFP-A

12、nxII WT和S11E質(zhì)粒的表達(dá)蛋白可以入核。以CNE1-LMP1細(xì)胞為代表，將WT和S11E質(zhì)粒分別與PKC α shRNA和/或PKCβ shRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1-LMP1細(xì)胞，依次與WT和S11E質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE1-LMP1細(xì)胞的胞漿、胞核蛋白中EGFP-Annexin A2融合蛋白的分布情況比較。結(jié)果表明，PKCα shRNA、PKCβ shRNA質(zhì)粒均能降低野生型和S11E突變質(zhì)粒表達(dá)蛋白的入核程度，進(jìn)一步證實了p-ser

13、-Annexin A2水平影響Annexin A2的入核，同時提示我們PKCα、PKCβ確實可以通過調(diào)控Annexin A2絲氨酸25位磷酸化影響其入核。 Annexin A2磷酸化而入核，入核后可提高DNA聚合酶α的活性，從而促進(jìn)DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。我們使用 CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay(Promega)，檢測Annexin A2絲氨酸25位磷酸化入核后對細(xì)胞增殖

14、的影響。結(jié)果表明兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了pEGFP-AnXII WT和S11E質(zhì)粒的細(xì)胞增殖速率明顯快于轉(zhuǎn)染了S25E和S11ES25E質(zhì)粒的細(xì)胞。提示我們由于Annexin A2絲氨酸25位突變后不能被PKC正常磷酸化，影響Annexin A2入核發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，從而進(jìn)一步確定了Annexin A2絲氨酸25位磷酸化對其生物學(xué)功能的重要性。 Annexin A2絲氨酸25位磷酸化與其入核密切相關(guān)，而絲氨酸11位沒有明顯影響。有

15、研究發(fā)現(xiàn)，四聚體形式的Annexin A2在細(xì)胞膜上被PKC磷酸化后，有利于四聚體從細(xì)胞膜上解離下來和其自身解離，而且這種解離主要由 Annexin A2的絲氨酸11位磷酸化所決定，可能是因為Ser11位于配體蛋白p11結(jié)合序列 (Annexin A2的氨基端1-13位)內(nèi)。LMP1是否介導(dǎo)PKCα和PKCβ使Annexin A2絲氨酸11位磷酸化，從而調(diào)節(jié)Annexin A2四聚體形式的解離和從細(xì)胞膜上的釋放，有待我們進(jìn)一步的研究。綜

16、上所述，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中，EB病毒LMP1可通過PI-PLC上調(diào)PKC激酶活性和Annexin A2絲氨酸磷酸化水平，即進(jìn)一步確定了“LMP1→PI-PLC→PKC→p-ser-Annexin A2”這條新的信號通路的存在。細(xì)胞內(nèi)實驗證明了LMP1介導(dǎo)PI-PLC-PKCα/βPKCβ信號通路增加Annexin A2絲氨酸磷酸化水平，并且主要通過激活PKCβ；同時活性激酶PKCα、PKCβⅠ和PKC βⅡ可以體外絲氨酸磷

17、酸化Annexin A2，從細(xì)胞外水平證明了Annexin A2是PKCα、PKCβⅠ和 PKCβⅡ的直接蛋白底物。Annexin A2在細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖；通過將Annexin A2氨基端絲氨酸11位和絲氨酸25位突變成谷氨酸，使這兩個位點不能被PKC正常磷酸化，進(jìn)一步證明Annexin A2絲氨酸25位的磷酸化影響其入核和促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能。 確定了“LMP1→PI-PLC→PKC α/PKC β→p-s