組蛋白H3Ser10磷酸化在EB病毒LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌變中的作用及調(diào)控通路的研究.pdf

1、表觀遺傳(epigenetics)是指DNA序列沒有發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，這種改變反映的是環(huán)境因素和遺傳因素的相互作用。與人類多數(shù)疾病一樣，腫瘤發(fā)生也有其自身的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。DNA甲基化水平紊亂和組蛋白修飾異常是人類腫瘤最常見的表觀遺傳學(xué)改變。組蛋白在翻譯完成后，其N-末端氨基酸殘基發(fā)生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等共價(jià)修飾，引起染色體結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。近年來，在人類多數(shù)腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有組蛋白修飾

2、酶和組蛋白修飾的異常。
　　組蛋白H3磷酸化是組蛋白修飾的重要方式之一，其中第10位絲氨酸(Ser10)磷酸化與有絲分裂染色體濃縮、細(xì)胞周期以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，在腫瘤研究領(lǐng)域中具有重要意義。已報(bào)道多種腫瘤促進(jìn)因子如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)、UVB和砷等以及原癌基因H-ras、v-Src均可

3、誘導(dǎo)組蛋白H3Ser10磷酸化，與即刻早期(immediate-early，IE)基因c-fos、c-jun、c-myc以及Cox-2等轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。在人類多種腫瘤組織中包括直腸癌、肝癌、宮頸癌和胃癌等均發(fā)現(xiàn)有組蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高，并且與腫瘤惡性程度相關(guān)。這些研究表明組蛋白H3Ser10磷酸化異?？赡苁钦{(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要表觀遺傳學(xué)改變。
　　大量研究證實(shí)各種體外刺激因素誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化涉及多條不

4、同的蛋白激酶信號通路，與特異性刺激/應(yīng)激及細(xì)胞類型有關(guān)。近年來，各種蛋白激酶包括MSK1（mitogen-and stress-activated kinase 1）、RSK2(ribosomal protein S6 kinase 2)、IKK-α(Ikappa B kinase-alpha)、PKC(cAMP dependent protein kinase C)、Fyn及PIM1等相繼被發(fā)現(xiàn)要參與調(diào)控不同刺激作用下組蛋白H3Ser

5、10磷酸化，誘導(dǎo)特異性基因轉(zhuǎn)錄。在原癌基因H-ras、v-Src以及EGF、TPA誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中，MSK1活化對于組蛋白H3Ser10磷酸化以及激活蛋白-1(activating protein-1，AP-1)轉(zhuǎn)錄激活是必需的。因此，明確特異性刺激作用下調(diào)控組蛋白H3磷酸化的蛋白激酶及其信號通路對闡明組蛋白H3磷酸化的作用具有重要意義。
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是高發(fā)于我國南方和

6、東南亞地區(qū)的一種頭頸部惡性腫瘤。流行病學(xué)調(diào)查顯示，鼻咽癌的病因主要與Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、遺傳因素及環(huán)境因素有關(guān)，EB病毒與環(huán)境危險(xiǎn)因素及宿主易感遺傳背景交互作用，促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。鼻咽癌發(fā)病的獨(dú)特病因體系提示:鼻咽癌是研究腫瘤表觀遺傳修飾的最佳模型之一。潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是目前唯一證實(shí)具有轉(zhuǎn)化功能的EBV基因編碼瘤

7、蛋白，與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LMP1的轉(zhuǎn)化作用在于它能異常激活A(yù)P-1、NF-κB、JAK/STAT信號通路和多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、侵襲與轉(zhuǎn)移。組蛋白H3Ser10磷酸化作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制，是否介導(dǎo)了LMP1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子活化和鼻咽細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，值得我們進(jìn)一步探討。
　　本課題以組蛋白H3Ser10磷酸化為切入點(diǎn)，從組織、細(xì)胞、分子水平研究組蛋白H3Ser10磷酸化在鼻咽癌變，尤其是在

8、EBV-LMP1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞惡性表型中的作用，并進(jìn)一步探討調(diào)控組蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶及信號通路，將有助于從表觀遺傳學(xué)角度揭示LMP1的致瘤機(jī)制和鼻咽癌的發(fā)生機(jī)制，為組蛋白H3Ser10磷酸化作為鼻咽癌診斷、治療的新靶標(biāo)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分組蛋白H3Ser10磷酸化在LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌變中的作用
　　第一章Ser10磷酸化組蛋白H3在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與LMP1表達(dá)的相關(guān)性
　　方法：<

9、br>　　1.免疫組織化學(xué)法檢測鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織以及癌旁/正常組織中組蛋白H3Ser10磷酸化水平。
　　2.免疫組織化學(xué)法檢測EBV-LMP1在鼻咽癌組織的表達(dá)，并分析與組蛋白H3Ser10磷酸化水平的相關(guān)性。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blotting檢測低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE2、高分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE1以及永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69中組蛋白H3Ser10磷酸化水平。
　　結(jié)果：

10、r>　　1.鼻咽癌組織中存在組蛋白H3Ser10磷酸化水平增高
　　組蛋白H3Ser10磷酸化在48例鼻咽癌組織、15例鼻咽炎癥組織和36例癌旁/正常鼻咽組織的陽性標(biāo)記指數(shù)(positive labeling index，PLI)分別為22.43±10.57、14.87±6.04和8.10±4.78，顯示鼻咽癌組織中組蛋白H3Ser10磷酸化水平要明顯高于慢性鼻咽炎癥組織(P＜0.05)和癌旁/正常鼻咽組織(P＜0.001)。慢性

11、鼻咽炎癥組織中H3Ser10磷酸化水平也要明顯高于癌旁/正常鼻咽組織(P＜0.005)。
　　2.鼻咽癌組織中LMP1的表達(dá)與組蛋白H3Ser10磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系
　　在48例鼻咽癌組織中，LMP1陽性表達(dá)為28例(58.3％，28/48)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LMP1的表達(dá)與組蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌組織中呈正相關(guān)關(guān)系(x2=6.700，P=0.01;C=0.350)。
　　3.鼻咽癌細(xì)胞中存在組蛋

12、白H3Ser10磷酸化水平增高
　　免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blotting結(jié)果顯示，與永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69相比，組蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌細(xì)胞中明顯增高，其中以CNE2細(xì)胞表達(dá)水平最高。
　　第二章EBV-LMP1誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化
　　方法：
　　1.免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blotting檢測CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化

13、水平。
　　2.Western blotting檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1基因引起CNE1細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平的改變。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染LMP1基因引起CNE1細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄活性的改變。
　　結(jié)果：
　　1.LMP1誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平增高
　　免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在血清饑餓條件下，組蛋白H3Ser10磷酸化的陽性細(xì)胞數(shù)在穩(wěn)定表達(dá)LMP1的C

14、NE1GL細(xì)胞中要明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CNE1G細(xì)胞，主要為有絲分裂間期細(xì)胞。Western blotting結(jié)果也顯示CNE1GL細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平明顯高于CNE1G細(xì)胞。此外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1基因亦可引起CNE1細(xì)胞組蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高，呈劑量依賴關(guān)系。
　　2.LMP1誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄激活
　　雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，轉(zhuǎn)染LMP1基因可促進(jìn)CNE1細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄活

15、性增高，呈劑量依賴關(guān)系。
　　第三章基因沉默組蛋白H3對LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響
　　方法：
　　1.構(gòu)建針對組蛋白H3基因和無關(guān)序列的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，與pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定沉默組蛋白H3基因的CNE1細(xì)胞株及陰性對照細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測組蛋白H3基因沉默效果。
　　2.采用CC

16、K-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測基因沉默組蛋白H3對LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測基因沉默組蛋白H3對LMP1誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄激活的影響。
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定干擾組蛋白H3基因表達(dá)的CNE1細(xì)胞株的建立
　　經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測組蛋白H3基因沉默效果，結(jié)果顯示，

17、與空白對照及陰性對照細(xì)胞相比，siRNA-H3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞中組蛋白H3的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)60％～70％。
　　2.基因沉默組蛋白H3抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力
　　與以往的報(bào)道相一致，轉(zhuǎn)染LMP1基因可促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖及克隆形成;但采用siRNA干擾組蛋白H3表達(dá)則可明顯抑制LMP1促進(jìn)的細(xì)胞增殖及克隆形成能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照細(xì)胞相比，基因沉默組蛋白H3的CNE1

18、細(xì)胞在培養(yǎng)48h后生長速度明顯減慢;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其克隆形成數(shù)量和克隆形成大小均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　3.基因沉默組蛋白H3抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活
　　雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，干擾組蛋白H3基因表達(dá)可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活，與陰性對照細(xì)胞相比，其轉(zhuǎn)錄活性下降62.49％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　第四章過表達(dá)野

19、生型和突變型組蛋白H3對LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響
　　方法：
　　1.將人組蛋白H3基因的cDNA重組于pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒以構(gòu)建組蛋白H3野生型真核表達(dá)質(zhì)粒(H3WT)，并以此為模板，通過反向PCR法對組蛋白H3基因第31位堿基進(jìn)行T→G的定點(diǎn)突變，獲得組蛋白H3突變型真核表達(dá)質(zhì)粒(H3S10A)。
　　2.將野生型和突變型組蛋白H3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CNE1細(xì)胞，殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定

20、過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株，Western blotting檢測轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
　　3.采用CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3對LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響。
　　4.Western blotting和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3對LMP1誘導(dǎo)的c-Jun、c-Fos蛋白表達(dá)以及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　

21、結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株的建立
　　經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，Western blotting結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染組蛋白H3野生型(H3WT)和突變型(H3S10A)質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞中均可檢測到標(biāo)簽(His)融合蛋白的表達(dá)，表明已成功構(gòu)建過表達(dá)組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株。
　　2.過表達(dá)野生型組蛋白H3促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

22、，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞相比，過表達(dá)野生型組蛋白H3可促進(jìn)CNE1細(xì)胞的增殖，細(xì)胞在培養(yǎng)72h后生長速度明顯增快;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)野生型組蛋白H3可促進(jìn)低血清條件下CNE1細(xì)胞克隆形成能力。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞相比，過表達(dá)野生型組蛋白H3可增強(qiáng)LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞錨定非依賴性生長能力，其克隆形成率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但過表達(dá)突變型組蛋白H3并沒有引起明顯改變。
　　3.過

23、表達(dá)野生型組蛋白H3增強(qiáng)LMP1誘導(dǎo)的c-Jun、c-Fos蛋白表達(dá)及AP-1轉(zhuǎn)錄活性
　　Western blotting結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞相比，過表達(dá)野生型組蛋白H3可增強(qiáng)LMP1誘導(dǎo)下c-Jun和c-Fos的蛋白表達(dá)水平;但過表達(dá)突變型組蛋白H3并沒有引起明顯改變。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，過表達(dá)野生型，而不是突變型組蛋白H3，可增強(qiáng)LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第二

24、部分調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶信號通路
　　第一章蛋白激酶MSK1調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化
　　方法：
　　1.免疫組織化學(xué)法檢測Thr581磷酸化MSK1在鼻咽癌組織及癌旁/正常組織中的表達(dá)，并分析與LMP1及Ser10磷酸化組蛋白H3在鼻咽癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。
　　2.Western blotting檢測CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中ERK1/2和MSK1磷酸

25、化水平，以及轉(zhuǎn)染LMP1基因引起CNE1細(xì)胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平的改變。
　　3.體外激酶活性實(shí)驗(yàn)檢測CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中組蛋白H3激酶活性，以及MSK1抑制劑H89預(yù)處理后組蛋白H3激酶活性的改變。
　　4.采用p-MSK1抗體免疫沉淀MSK1激酶，體外激酶活性實(shí)驗(yàn)檢測CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中MSK1激酶活性。
　　5.ERK1/2抑制劑PD98059和MSK1抑制劑H89處理細(xì)胞，We

26、stern blotting檢測CNE1細(xì)胞中LMP1誘導(dǎo)組蛋白H3Ser10磷酸化水平的改變。
　　6.構(gòu)建針對MSK1基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，與pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定沉默MSK1基因的CNE1細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測MSK1基因沉默效果。
　　7.Western blotting檢測干擾MSK1基因表達(dá)對LMP1誘導(dǎo)

27、組蛋白H3Ser10磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.鼻咽癌組織中存在MSK1Thr581磷酸化水平增高
　　48例鼻咽癌組織和36例癌旁/正常鼻咽組織的免疫組化結(jié)果顯示，MSK1Thr581磷酸化水平在鼻咽癌組織中要明顯高于癌旁/正常鼻咽組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　2.鼻咽癌組織中LMP1的表達(dá)與MSK1Thr581磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系
　　在48例鼻咽癌組織中，相關(guān)性分析結(jié)果

28、顯示，LMP1的表達(dá)與MSK1Thr581磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系(x2=9.600，P=0.002;C=0.408);并且MSK1磷酸化水平與組蛋白H3Ser10磷酸化水平亦呈正相關(guān)關(guān)系（x2=11.959，P=0.001;C=0.447）。
　　3.LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞中MSK1Thr581磷酸化水平的增高
　　Western blotting結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)LMP1的CNE1GL細(xì)胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水

29、平明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CNE1G細(xì)胞。此外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1基因也可促進(jìn)CNE1細(xì)胞中ERK1/2及MSK1磷酸化水平的增高，呈劑量依賴關(guān)系。
　　4.LMP1增強(qiáng)CNE1細(xì)胞中組蛋白H3激酶活性
　　體外激酶活性分析顯示，與CNE1G細(xì)胞相比，CNE1GL細(xì)胞蛋白提取液中組蛋白H3激酶活性明顯增高，但給予MSK1抑制劑H89預(yù)處理后，兩種細(xì)胞的組蛋白H3激酶活性均出現(xiàn)降低。
　　5.LMP1增強(qiáng)CNE1細(xì)胞中MSK1

30、激酶活性
　　采用p-MSK1抗體免疫沉淀MSK1蛋白，Western blotting結(jié)果顯示，p-MSK1抗體能有效地將蛋白提取液中MSK1激酶下拉。體外激酶活性分析顯示，與CNE1G細(xì)胞相比，來自CNE1GL細(xì)胞的免疫沉淀復(fù)合物的MSK1激酶活性明顯增強(qiáng)。
　　6.PD98059和H89抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化
　　Western blotting結(jié)果顯示，較低濃度的PD98059（10μmo

31、l/L）和H89（5μmol/L）即能明顯降低LMP1誘導(dǎo)的H3Ser10磷酸化水平，呈劑量依賴關(guān)系。
　　7.穩(wěn)定干擾MSK1基因表達(dá)的CNE1細(xì)胞株的建立
　　經(jīng)殺稻瘟霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測MSK1基因沉默效果，結(jié)果顯示，與陰性對照細(xì)胞相比，siRNA-MSK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞中MSK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)70％～80％。
　　8

32、.基因沉默MSK1抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化
　　Western blotting結(jié)果顯示，與陰性對照細(xì)胞相比，采用siRNA干擾MSK1基因表達(dá)可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化。
　　第二章蛋白激酶MSK1在LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中的作用
　　方法：
　　1.采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測H89或基因沉默MSK1對LMP1促

33、進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響。
　　2.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測H89或基因沉默MSK1對LMP1誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄激活的影響。
　　結(jié)果：
　　1.H89或基因沉默MSK1抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照細(xì)胞相比，干擾MSK1基因表達(dá)可抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞增殖，細(xì)胞在培養(yǎng)48h后生長速度明顯減慢;采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示，與陰性對照

34、細(xì)胞相比，干擾MSK1基因表達(dá)可引起Go/G1期細(xì)胞比例增加(P＜0.001)，而S期細(xì)胞比例減少(P＜0.001)，提示阻滯細(xì)胞周期G1/S進(jìn)程可能是下調(diào)MSK1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖的重要原因。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H89或基因沉默MSK1表達(dá)均可明顯抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞克隆形成能力，其克隆形成數(shù)量和克隆形成大小均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　2.H89或基因沉默MSK1抑制LMP

35、1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活
　　雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，與未處理組細(xì)胞相比，5μmol/LH89即可明顯降低LMP1誘導(dǎo)的AP-1活性，呈劑量依賴關(guān)系;同樣，采用siRNA干擾MSK1基因表達(dá)亦可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活，與陰性對照細(xì)胞相比，其轉(zhuǎn)錄活性下降57.21％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　第三章TAK1通過激活p38/MSK1通路參與調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化
　

36、　方法：
　　1.采用TAK1抗體免疫沉淀TAK1激酶，以MKK6重組蛋白為底物，體外激酶實(shí)驗(yàn)檢測LMP1誘導(dǎo)TAK1激酶活性的改變。
　　2.用活化的TAK1-TAB1激酶與組蛋白H3蛋白進(jìn)行體外激酶反應(yīng)，Western blotting檢測TAK1能否體外磷酸化組蛋白H3。
　　3.CNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染LMP1基因，免疫熒光和免疫共沉淀法檢測TAK1和Ser10磷酸化組蛋白H3在細(xì)胞內(nèi)定位及其結(jié)合情況。
　　4.

37、構(gòu)建針對TAK1基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，與pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定沉默TAK1基因的CNE1細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測TAK1基因沉默效果。
　　5.Western blotting檢測TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1對LMP1誘導(dǎo)組蛋白H3磷酸化的影響。
　　6.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測5z

38、-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1對LMP1誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄激活的影響。
　　7.Western blotting檢測5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1對LMP1誘導(dǎo)MAPK通路激酶ERK1/2、p38和MSK1磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.LMP1增強(qiáng)CNE1細(xì)胞TAK1激酶活性
　　采用TAK1抗體免疫沉淀TAK1蛋白，Western blotting結(jié)果顯示，TAK1抗體能

39、有效地將蛋白提取液中TAK1激酶下拉。體外激酶活性分析顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染LMP1基因能夠增強(qiáng)CNE1細(xì)胞中TAK1激酶活性。
　　2.活化的TAK1-TAB1激酶體外磷酸化組蛋白H3
　　Western blotting結(jié)果顯示，活化的TAK1-TAB1激酶能引起組蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高，呈劑量依賴關(guān)系，提示TAK1-TAB1激酶能在體外磷酸化組蛋白H3。
　　3.TAK1與Ser10磷酸化組蛋白

40、H3可能不存在細(xì)胞內(nèi)共定位
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在LMP1誘導(dǎo)下，TAK1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，未見有明顯核轉(zhuǎn)移，提示TAK1與磷酸化組蛋白H3可能不存在細(xì)胞核內(nèi)共定位。免疫共沉淀結(jié)果顯示TAK1與磷酸化組蛋白H3未見有明顯結(jié)合。
　　4.穩(wěn)定干擾TAK1基因表達(dá)的CNE1細(xì)胞株的建立
　　經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測TAK1基因沉默效果，結(jié)果顯

41、示，與陰性對照細(xì)胞相比，siRNA-TAK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞中TAK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)70％～80％。
　　5.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化
　　Western blotting結(jié)果顯示，與未處理組細(xì)胞相比，給予TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol作用細(xì)胞可降低LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化水平，呈劑量依賴關(guān)系，而H3Ser2

42、8磷酸化水平未見明顯改變。TAK1 siRNA結(jié)果與其一致。
　　6.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活
　　雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，與未處理組細(xì)胞相比，給予5z-7-oxozeaenol作用細(xì)胞可降低LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄活性，呈劑量依賴關(guān)系。同樣，采用siRNA干擾TAK1基因表達(dá)亦可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活，與陰性對照細(xì)胞相比，其轉(zhuǎn)錄活性下降59.3

43、8％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.005)。
　　7.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1抑制LMP1誘導(dǎo)的p38和MSK1磷酸化
　　Western blotting結(jié)果顯示，給予5z-7-oxozeaenol處理或基因沉默TAK1均能有效抑制LMP1誘導(dǎo)的CNE1細(xì)胞p38和MSK1激酶的磷酸化水平，而ERK1/2磷酸化水平未見明顯改變，提示TAK1通過p38MAPK通路，而不是ERK1/2，調(diào)控MSK1活性。

44、
　　結(jié)論：
　　1.鼻咽癌組織中組蛋白H3Ser10磷酸化水平明顯增高;EBV-LMP1可誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞組蛋白H3Ser10磷酸化。
　　2.組蛋白H3，尤其是Ser10磷酸化，在LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中起重要調(diào)控作用，與其介導(dǎo)AP-1活性有關(guān)。
　　3.MSK1作為組蛋白H3激酶，直接調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的CNE1細(xì)胞組蛋白H3Ser10磷酸化;并在LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，