美伐他汀生物合成酰基轉移酶mlcH的克隆、表達及其定向突變研究.pdf

1、近年來，隨著高血脂癥的急劇增加，降血脂藥市場在逐漸升溫。醫(yī)學界公認高膽固醇血癥與動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病之間存在明顯的相關性，血清總膽固醇特別是低密度脂蛋白膽固醇水平的升高，對于疾病的發(fā)生、發(fā)展起著尤其重要的作用。他汀類藥物是膽固醇合成途徑關鍵調控酶HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A)還原酶的競爭性抑制劑，能夠有效地降低內源性膽固醇的合成，同時又代償性增加臟器細胞內低密度脂

2、蛋白受體(LDLR)的合成，提高對血液中低密度脂蛋白(LDL)的攝取，降低血液中總膽固醇的含量，最終達到降低血脂的目的。他汀類藥物與傳統降脂藥物相比，其降低血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇效果顯著、副作用少、安全性高，成為降血脂藥物中的首要選擇。美伐他汀是最早發(fā)現的他汀類化合物，隨后通過對其結構類似物的尋找，發(fā)現了全球第一個通過FDA批準上市的HMG-CoA還原酶抑制劑——洛伐他汀，美伐他汀目前主要作為工業(yè)上生物轉化生產普法他汀的直接前體

3、。
　　 美伐他汀生物合成基因簇及假想的生物合成途徑的研究表明美伐他汀是一類典型的聚酮類化合物，其合成是在聚酮合成酶(PKS)的參與下完成的，對于關鍵調控酶功能活性的研究為更好的開發(fā)美伐他汀提供了新的思路和依據。美伐他汀生物合成基因簇全長38kb，其中mlcH基因長約1257bp，編碼推測的酰基轉移酶，分子量大小約為46kD。研究表明，lovD基因編碼的?；D移酶負責將?；鶞y鏈連接到莫那可林J的C8位形成洛伐他汀，這種?；D移酶

4、對于底物?；鶞y鏈、萘環(huán)具有廣泛的寬容性，利用這種寬容性成功一步轉化莫那可林J生成辛伐他汀。輝伐他汀是一種報道的具有更優(yōu)降脂活性的他汀化合物，體外驗證mlcH基因編碼的?；D移酶活性，在全細胞的條件下，利用其底物寬容性一步轉化6-羥基-6-去甲基莫那可林J生成輝伐他汀具有一定的應用前景。
　　 本文利用RT-PCR技術成功地克隆了美伐他汀產生菌橘青霉(Penicillium citrinum)中美伐他汀生物合成基因簇中的mlcH基

5、因，通過測序及序列比對證實，序列全憐1257bp,編碼418個氨基酸，與(Penicillium citrinum)mlcH的蛋白序列(登錄號：AB072893)相比只有一個氨基酸的差異，即1064位一個堿基的突變導致谷氨酸被甘氨酸所取代。將目的基因片段構建到原核表達載體pET28a(+)上，以E.coli BL21(DE3)為宿主添加IPTG誘導表達重組蛋白以包涵體形式存在，利用8M尿素對其進行變性，采用Ni2+-NTA agaros

6、e親和層析柱對目的蛋白進行純化，然后利用添加了L-精氨酸、甘油、Triton-X100等組份的透析原液成功透析復性目的蛋白，在添加了4 mM美伐他汀、10μM MlcH的HEPES反應體系中，HPLC檢測出新峰的出現，從而證實了MlcH的美伐他汀水解活性，研究不同pH(6.5-9)對酶催化水解反應的影響，表明酶的最適pH為8.0，在最適pH值條件下研究不同溫度對于酶反應的影響，表明酶反應的最適溫度為45℃。向Swiss-Model Re

7、pository提交橘青霉MlcH的氨基酸序列，服務器自動搜索與之匹配的最佳模板為Burkholderia gladioli的酯酶EstB，利用pymol軟件對MlcH蛋白的空間結構進行模擬分析，推測空間表面的Cys65對于分子交聯起一定作用，運用大引物PCR方法成功進行MlcH蛋白C65A的定點突變，突變后蛋白的溶解性實驗表明，包涵體蛋白的含量明顯減少。
　　 隨著他汀類藥物研究的不斷深入，利用分子生物學方法來研究他汀生物合成