人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA體系構(gòu)建及其抑制效應(yīng)觀察.pdf

1、腎臟纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展到后期的病理學(xué)改變，其本質(zhì)是以細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚為特征的病理過(guò)程。Ⅰ型膠原在細(xì)胞外基質(zhì)聚集中起著不可或缺的作用，其中編碼為COL1A1的αl(Ⅰ)起著主要的生物學(xué)作用。利用RNA干涉技術(shù)下調(diào)Ⅰ型膠原基因的過(guò)度表達(dá)，以期成為延緩腎臟纖維化的新方法。 第一部分：人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA的設(shè)計(jì)篩選和鑒定 目的：針對(duì)Ⅰ型膠原αL(Ⅰ)鏈設(shè)計(jì)并篩選人鼠同源Ⅰ型膠原 siRNA(COL1A1-s

2、iRNA)，并證實(shí)其有效性。 方法：根據(jù)已知的設(shè)計(jì)原則，利用軟件設(shè)計(jì)人鼠完全同源的一對(duì)Ⅰ型膠原siRNA序列。將非特異性帶有熒光的siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞，顯微鏡下觀察大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。直接將Ⅰ型膠原siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞，利用RT-PCR的方法觀察對(duì)大鼠系膜細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的抑制作用。 結(jié)果：大鼠系膜細(xì)胞可以轉(zhuǎn)染非特異性siRNAI型膠原，從而可以作為siRNA實(shí)驗(yàn)研究的載體，轉(zhuǎn)染效率約為53.9％。

3、將Ⅰ型膠原siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞，與空白對(duì)照組及MOCK組比較，各siRNA組均可見(jiàn)特異性513bpCOL1A1基因條帶，并隨siRNA濃度增加，條帶逐漸減暗?？梢?jiàn)Ⅰ型膠原siRNA使Ⅰ型膠原表達(dá)下調(diào)，并具劑量依賴性。 結(jié)論：所設(shè)計(jì)的Ⅰ型膠原siRNA為人與大鼠完全同源的siRNA序列，所有堿基完全匹配。可以成功轉(zhuǎn)染到大鼠系膜細(xì)胞，并有效抑制Ⅰ型膠原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 第二部分人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

4、 目的：建立Ⅰ型膠原siRNA表達(dá)質(zhì)粒，使其作用時(shí)間更長(zhǎng)，表達(dá)更穩(wěn)定。 方法：將所確定的Ⅰ型膠原siRNA作為靶點(diǎn)，合成64 nt的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)退火、T4多聚核苷酸激酶處理，與經(jīng)BamH Ⅰ和PstⅠ酶切的線性化質(zhì)粒pCGPU6/GFP/Neo定向連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞，RT-PCR觀察抑制作用。 結(jié)果：與空白對(duì)照組、mock組電泳條帶比較，各siRNA質(zhì)粒

5、組均可見(jiàn)特異性513bp COL1A1基因條帶，并隨siRNA質(zhì)粒濃度增加，條帶逐漸減暗?？梢?jiàn)Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒同樣使Ⅰ型膠原表達(dá)下調(diào)，效果顯著，并具劑量依賴性。 結(jié)論：采用質(zhì)粒載體的方法同樣可以達(dá)到抑制Ⅰ型膠原形成的作用，而且表達(dá)更穩(wěn)定，作用更顯著。 第三部分 人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA對(duì)TGF-β<,1>誘導(dǎo)Ⅰ型膠原表達(dá)的抑制作用 目的：觀察病理情況下Ⅰ型膠原siRNA對(duì)人TGF-β<,1>誘導(dǎo)Ⅰ型膠原表

6、達(dá)的抑制作用。 方法：選用人TGF-β<,1>誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)，觀察表達(dá)效果。并利用Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒抑制其表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)TGF-β<,1>誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原基因的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并隨TGF-β<,1>劑量的增大，效果更顯著。經(jīng)刺激因子TGF-β<,1>誘導(dǎo)后，再轉(zhuǎn)染Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒，可見(jiàn)與空白對(duì)照組、mock組比較，各刺激因子組條帶逐漸增強(qiáng)，及單純予以刺激因子誘導(dǎo)的相對(duì)應(yīng)各組比較，轉(zhuǎn)染siRNA組條帶