Ki67啟動(dòng)子調(diào)控的荷載雙基因RNA干擾的條件增殖腺病毒靶向治療腎癌體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究Ki67啟動(dòng)子調(diào)控的荷載Ki67-siRNA、hTERT-siRNA及Ki67-siRNA+hTERT-siRNA(double-siRNA)的條件增殖型腺病毒對腎癌的體外治療效果。
　　 方法：Ki67-ZD55、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA、Ki67-ZD55-hTERT-siRNA、Ki67-ZD55-double-siRNA腺病毒大量擴(kuò)增后測定滴度；將上述四種腺病毒分別感染腎癌KETR-3、786-

2、O、ACHN細(xì)胞及正常HK-2細(xì)胞，Western Blot檢測腺病毒E1A蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況；TCID50檢測腺病毒在細(xì)胞中的復(fù)制能力；RT-PCR檢測腺病毒對細(xì)胞中Ki67基因、hTERT基因的沉默效果；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測腺病毒對細(xì)胞中Ki67蛋白及hTERT蛋白表達(dá)的抑制情況；CCK-8法檢測腺病毒對細(xì)胞增殖的影響；Annexin V-FITC/PI法檢測腺病毒對細(xì)胞凋亡的影響；結(jié)晶紫染色檢測腺病毒的細(xì)胞毒性作用。
　　

3、 結(jié)果：1.在腎癌KETR-3、786-O、ACHN細(xì)胞中，四組病毒均表達(dá)E1A蛋白，同一細(xì)胞中Ki67-ZD55-double-siRNA組E1A蛋白表達(dá)量較Ki67-ZD55組、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組E1A蛋白表達(dá)量多，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其病毒復(fù)制能力也最強(qiáng)，Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組E1A蛋

4、白表達(dá)量較Ki67-ZD55組E1A蛋白表達(dá)量多，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ki67-ZD55的病毒復(fù)制能力也最弱，而Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組E1A蛋白表達(dá)量無差異(P>0.05)；在KETR-3、786-O、ACHN細(xì)胞中四種病毒E1A蛋白表達(dá)量是逐漸降低的，四種病毒在KETR-3細(xì)胞中顯示最強(qiáng)的復(fù)制能力，在786-O細(xì)胞中其次，在ACHN細(xì)胞中最弱；在HK-2細(xì)胞

5、中未檢測到E1A蛋白的表達(dá)，四種病毒也無復(fù)制能力。
　　 2.RT-PCR檢測結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示在腎癌KETR-3、786-O、ACHN細(xì)胞中，Ki67-ZD55-double-siRNA組及Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組的Ki67 mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)均明顯降低，與其它組和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ki67-ZD55-double-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siR

6、NA組的hTERT mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)均明顯降低與其他組和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四種腺病毒在KETR-3細(xì)胞中作用最明顯，在786-O細(xì)胞中作用其次，在ACHN細(xì)胞中作用較弱；在HK-2細(xì)胞中，各組的Ki67及hTERT的mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)無差異(P>0.05)。
　　 3.CCK-8法、結(jié)晶紫染色法及AnnexinV-FITC/PI法顯示四種病毒對腎癌KETR-3、786-O、ACHN細(xì)胞

7、均有殺傷作用、增殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且CCK-8法顯示病毒對細(xì)胞增殖的抑制作用與病毒的濃度及感染時(shí)間存在正相關(guān)性，其中Ki67-ZD55-double-siRNA組對腎癌細(xì)胞的殺傷作用、增殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ki67-ZD55-Ki67-siRNA組及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA組作用其次，兩組間無差異(P>0.05)；Ki67-ZD55組對腎癌細(xì)胞的殺傷作用、增

8、殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用最弱，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四種腺病毒在KETR-3細(xì)胞中作用最明顯，在786-O細(xì)胞中作用其次，在ACHN細(xì)胞中作用較弱；四種病毒對HK-2細(xì)胞均無明顯殺傷作用、增殖抑制作用作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建的攜帶Ki67啟動(dòng)子、Ki67-siRNA及hTERT-siRNA的條件增殖型腺病毒Ki67-ZD55、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA、Ki67-ZD55-h