IL-21RmRNA在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平及其檢測(cè)意義研究.pdf

1、目的：建立檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者（rheumatoid arthritis，RA）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中IL-21RmRNA的套式實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Nested-Real-Time-PCR）的方法，（1）研究IL-21RmRNA在RA PBMC中的表達(dá)水平并探討其臨床意義；（2）探討IL-21RmRNA在RA骨破壞中的作用，進(jìn)一步揭示RA的發(fā)病機(jī)制；（3）探討IL-21RmRNA與RA患者血清中IL-21（interleukin

2、-21）含量及外周血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性；（4）探討IL-21RmRNA在RA患者中醫(yī)不同證型中的表達(dá)水平及其檢測(cè)意義。 方法：根據(jù)IL-21RmRNA序列，跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)外引物，采用套式實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。首次擴(kuò)增以增加原始模板濃度，并以減少引物、酶的濃度及循環(huán)次數(shù)的方法保持?jǐn)U增片段的特異性，再以首次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增作實(shí)時(shí)熒光定量（Real-Time-PCR）檢測(cè)，同時(shí)以β-actin作

3、內(nèi)參；以二者比值作為IL-21RmRNA表達(dá)水平的指標(biāo)。同時(shí)采用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附法（ELISE）測(cè)定RA患者血清中IL-21的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EDTA-K2抗凝外周血中CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)為IL-21RmRNA的特異性目的片段。Ct值和模板起始濃度對(duì)數(shù)值之間具有良好的線性關(guān)系；檢測(cè)最低濃度可達(dá)101拷貝。ELISA法測(cè)RA患者血清中IL-21的含量，相關(guān)系數(shù)為0.9984。

4、60例RA患者與30例健康人群相比，RA患者組基因IL-21RmRNA表達(dá)水平及血清中IL-21含量上調(diào)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著差異（P<0.01）。將R患者關(guān)節(jié)功能分級(jí)組別作IL-21RmRNA及IL-21表達(dá)水平比較；Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)相比兩者均無(wú)顯箸差異（P>0.05），Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)分別與Ⅲ級(jí)以上相比，差異均顯著（P<0.01）。RA活動(dòng)期IL-21RmRNA及IL-21水平均較非活動(dòng)期增高，RA患者經(jīng)治療后兩者的表達(dá)水平均明顯下調(diào)；治療前后

5、比較均具有顯著差異（P<0.01）。中醫(yī)證型之間兩兩比較均沒(méi)有顯著性差異。將60例RA患者PBMC中IL-21RmRNA的表達(dá)水平與血清中IL-21含量及外周血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞數(shù)量作Pearson相關(guān)分析，IL-21RmRNA表達(dá)水平與血清中IL-21的含量顯著相關(guān)，而與外周血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞數(shù)量無(wú)相關(guān)性。 結(jié)論：RA患者IL-21RmRNA及IL-21的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，兩者表達(dá)水平和RA疾病嚴(yán)重程度