砷損害學(xué)習(xí)記憶能力與NMDA受體功能變化的關(guān)系研究.pdf

1、前言及目的： 砷(Arsenic，As)是一種類(lèi)金屬，在自然界廣泛分布于巖石、土壤和水環(huán)境中。世界上大約有20多個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)有地砷病病區(qū)或高砷區(qū)存在，飲用含砷超過(guò)0.0.mg/L水的人口在5000萬(wàn)人以上，慢性砷中毒患者達(dá)數(shù)十萬(wàn)。孟加拉、印度和中國(guó)是全世界病情最重、病區(qū)面積最大、受危害人口最多的國(guó)家。在我國(guó)目前暴露于飲用水砷濃度等于或超過(guò)0.0.mg/L的人口為560萬(wàn)，暴露在飲用水砷濃度等于或超過(guò)0.0.mg/L的人口為1466

2、萬(wàn)，這還不包括由于燃煤引起的燃煤型地方性砷中毒。 砷對(duì)健康的危害是多方面的，可引發(fā)多器官的組織學(xué)和功能上的異常改變，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致癌癥，臨床上以末梢神經(jīng)炎、皮膚色素代謝異常、掌跖部皮膚角化、肢端缺血壞疽、皮膚癌變?yōu)橹饕憩F(xiàn)。兒童每單位體重的日平均砷攝入量要高于人一生的日平均攝入量(特別是當(dāng)砷來(lái)源于土壤時(shí)，因?yàn)閮和薪赜螒蚣皭?ài)吮吸手的習(xí)慣)，而且由于兒童處于生理發(fā)育階段對(duì)化學(xué)物質(zhì)的毒作用更為敏感。流行病學(xué)調(diào)查顯示，砷中毒對(duì)青少年

3、的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害主要表現(xiàn)為對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的損害。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流行病學(xué)調(diào)查一致。目前，砷致學(xué)習(xí)記憶能力損害的分子機(jī)理尚不十分清楚。 海馬是腦邊緣系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)之一，是學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，IXP)現(xiàn)被認(rèn)為是海馬學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞突觸模式，在細(xì)胞水平檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力的最經(jīng)典的指標(biāo)。N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體是興奮型氨基酸特異性受體的一種、具有許多不同變構(gòu)調(diào)控

4、位點(diǎn)并對(duì)Ca2+高度通透的配體門(mén)控性離子通道，是由NR1、NR2(A-D)和NR3(A-B)亞單位組成的異聚體，近年來(lái)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶中的關(guān)鍵物質(zhì)而受到人們的關(guān)注。NMDA受體的亞基組成、受體胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在LTP的誘導(dǎo)和維持中起重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，急、慢性砷暴露可以抑制大鼠海馬LTP的誘導(dǎo)和維持。因此，我們推測(cè)砷可能通過(guò)影響NMDA受體各亞基的表達(dá)水平及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而損害青少年的學(xué)習(xí)記憶能力。 本研究以幼鼠為模型，通

5、過(guò)飲水砷染毒，觀察砷暴露對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、對(duì)NMDA受體各亞基的表達(dá)水平及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，以探討砷致學(xué)習(xí)記憶損害的分子機(jī)制，為防治砷中毒提供理論依據(jù)。 方法： 1.選用斷乳健康SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠180只，體重40-50 g，在標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。對(duì)照組大鼠飲用滅菌自來(lái)水，實(shí)驗(yàn)組大鼠分別飲用2.72 mg/L、13.6 mg/L和68 mg/L亞砷酸鈉水溶液。飲水每?jī)商旄鼡Q一次。染

6、毒時(shí)間分別為：1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月。用Morris水迷宮對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)終期，大鼠經(jīng)10％水合氯醛腹腔麻醉，心臟采血后，斷頭分離腦組織，將腦組織在冰冷生理鹽水中漂洗，用濾紙吸干，置于-70℃冰箱保存。 2.采用微波消解-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)測(cè)定血砷、腦砷含量。分別取全血0.5 mL、腦組織0.2 g于聚四氟乙烯管，經(jīng)微波消解儀消化。測(cè)量前，每個(gè)樣品加5 ml5％硫脲+5％抗壞血酸，然后用5％鹽酸

7、定容，混勻，用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定血砷和腦砷含量。砷的測(cè)定采用砷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)量控制。 3.用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力改變，測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)和可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)三個(gè)部分。 4.大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，斷頭，在冰上快速分離海馬，用雙面刀片切取1 mm3海馬CA1區(qū)組織塊，2.5％的戊二醛溶液4℃固定24 h。漂洗，1％鋨酸后固定，丙酮脫水，飽和醋酸鈾電子染色，環(huán)氧樹(shù)脂-618包埋。半薄切

8、片(片厚1μm)，。TECNAI-10電子顯微鏡觀察，照相。 5.收集暴露3個(gè)月的大鼠海馬，采用RT-PCR、Western-blot和免疫組化法檢測(cè)海馬中NMDA受體NR1、NR2A、NR2B亞基基因和蛋白表達(dá)。 6.檢測(cè)飲水砷暴露對(duì)大鼠海馬NMDA受體信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。用SignaTECT蛋白激酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定CaMKII活性，用Western-blot檢測(cè)CaMKIIα的蛋白表達(dá)及磷酸化狀態(tài)；用Western-b

9、lot檢測(cè)PSD-95、SynGAP、ERK1/2蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠外觀和一般情況良好，沒(méi)有出現(xiàn)中毒癥狀。從第六周開(kāi)始，68 mg/L劑量組大鼠體重增幅減慢，與對(duì)照組和其它兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這種差異一直維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 2.在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血砷、腦砷值均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，砷在大鼠血液和腦組織中有不

10、同程度的蓄積，我們成功的建立了砷中毒大鼠模型。 3.染毒1個(gè)月和2個(gè)月的大鼠，空間學(xué)習(xí)記憶能力受損不明顯；染毒3個(gè)月，砷暴露組大鼠逃逸潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)，而空間探索實(shí)驗(yàn)和可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明砷暴露組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶損害。 4.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，砷暴露組能見(jiàn)到較多變性神經(jīng)元，胞體皺縮變小，形態(tài)不規(guī)則；胞漿濃縮，基質(zhì)染色變深；細(xì)胞器腫脹、空化，線粒體腫脹，脊減少或無(wú)脊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RER擴(kuò)張

11、。毛細(xì)血管周?chē)Y(jié)構(gòu)明顯水腫，血管管腔不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞中部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、線粒體可見(jiàn)明顯的擴(kuò)張。突觸前成分中突觸小泡數(shù)量較少，軸突空化，軸突質(zhì)淡。 5.飲水砷暴露后，大鼠海馬NMDA受體NR2A亞基的mRNA和蛋白表達(dá)都受到抑制，與對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而NR1和NR2B亞基的mRNA和蛋白表達(dá)沒(méi)有受到明顯影響。 6.砷暴露后，大鼠海馬CaMKII活性受到明顯抑制，與對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

12、<0.05)；CaMKIIα的蛋白表達(dá)及磷酸化狀態(tài)沒(méi)有改變。砷暴露后，PSD-95、ERK1/2蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，而SynGAP蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。 結(jié)論： 1.飲水砷暴露后，砷能進(jìn)入血液循環(huán)，透過(guò)血腦屏障在腦組織內(nèi)蓄積，引起腦組織超微結(jié)構(gòu)改變，損害大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。 2.砷暴露抑制NMDA受體NR2A亞基的表達(dá)，對(duì)NR1和NR2B亞基表達(dá)沒(méi)有明顯影響。NMDA受體亞基表達(dá)的改變，會(huì)影