類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎CD4+T細(xì)胞上CD28的表達(dá)與凋亡的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的全身性自身免疫性疾病，呈慢性侵蝕性的炎癥過程，其致殘率高，對病人的心理狀況和生命質(zhì)量帶來極大的負(fù)面影響。研究顯示，免疫系統(tǒng)的所有組成部分均參與介導(dǎo)組織損害和系統(tǒng)炎癥。雖然最突出的免疫病理事件發(fā)生在關(guān)節(jié)部位和滑膜中，但免疫異常并不限于滑膜滲出的淋巴細(xì)胞的活化和克隆擴(kuò)增，還包括循環(huán)中大部分的T細(xì)胞。T細(xì)胞，尤其是CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的自身免疫反

2、應(yīng)一直被認(rèn)為在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。CD28是眾多協(xié)同刺激分子中最重要的一個(gè)。CD28可與抗原呈遞細(xì)胞上的CD80和CD86結(jié)合，啟動(dòng)協(xié)同刺激信號，并在提高T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性、誘導(dǎo)抗凋亡基因表達(dá)、增加細(xì)胞因子的分泌、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞與APC的結(jié)合和阻止T淋巴細(xì)胞的失能(anergy)等方面有著重要的作用。CD28的重要作用提示，通過調(diào)節(jié)CD28的表達(dá)水平會改變T細(xì)胞的功能。近來國外的一些研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血中存在缺乏CD28表達(dá)

3、的CD4+T細(xì)胞的擴(kuò)增和持續(xù)存在。盡管缺乏CD28介導(dǎo)的信號對T細(xì)胞刺激的作用，RA患者體內(nèi)的CD4+CD28-T細(xì)胞并非無能。這提示了RA中的CD28-T細(xì)胞是一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞群體。對此國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。鑒于T細(xì)胞在疾病進(jìn)程的中心作用及國內(nèi)研究空白，我們提出這樣的問題：漢族人群的RA患者是否也存在CD4+CD28-T細(xì)胞的擴(kuò)增?若CD4+CD28-T細(xì)胞亞群在RA患者體內(nèi)出現(xiàn)及持續(xù)存在，是否存在凋亡途徑的異常?是否由于該細(xì)胞亞群的異常特

4、性從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變參與RA的發(fā)病?CD4+CD28-T細(xì)胞亞群是否與疾病的臨床表現(xiàn)、活動(dòng)度及預(yù)后相關(guān)?為回答上述問題，我們設(shè)立了本研究。 目的：檢測外周血T細(xì)胞亞群上CD28分子的表達(dá)水平，并通過細(xì)胞培養(yǎng)觀察RA患者淋巴細(xì)胞對凋亡的易感性及其凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax的表達(dá)情況，明確RA患者是否存在CD4+CD28-T細(xì)胞擴(kuò)增及其與外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性，進(jìn)一步探討RA患者是否由于大量的CD4+CD28-T細(xì)

5、胞的存在導(dǎo)致機(jī)體的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變參與發(fā)病，從而深刻影響疾病的臨床表現(xiàn)甚至預(yù)后。 材料與方法：根據(jù)1987年美國風(fēng)濕學(xué)會(ACR)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將確診為RA的35名患者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；30名排除自身免疫性疾病史的健康漢族人作為正常對照組。兩組間性別和年齡無顯著差異。從外周血分離淋巴細(xì)胞，一部分直接上流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+T細(xì)胞上CD28表達(dá)情況和早期凋亡率(AnnexinV-FITC/PI雙染色)，一部分細(xì)胞予PHA刺激淋巴細(xì)胞

6、以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖活化，培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-FITC/PI雙染色)和共聚焦顯微鏡(AO/EB雙染色)檢測凋亡率；并進(jìn)行細(xì)胞涂片免疫組化法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax的表達(dá)情況，顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；不同指標(biāo)間的相關(guān)性用Spearman分析。 結(jié)果：

7、 (1)RA組CD4+CD28-T細(xì)胞比例的均數(shù)明顯高于健康對照組(5.58±6.41％vs1.91±1.48％，P＜0.05)，RF≥100U/ml的患者CD4+CD28-T細(xì)胞比例明顯高于RF＜30U/ml和30≤RF＜100U/ml的患者(13.26±7.10％vs4.50±3.03％、1.42±1.62％；p＜0.01)； (2)新鮮分離的淋巴細(xì)胞凋亡率兩組間無顯著性差異；予PHA刺激淋巴細(xì)胞活化24小時(shí)后檢測的凋亡

8、顯示RA組的凋亡率明顯低于對照組(流式細(xì)胞術(shù)：12.08±6.06％vs18.66±7.27％，p＜0.05；共聚焦顯微鏡：6.14±1.86％vs19.27±3.75％，p＜0.001)，并與DAS28評分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.617，p=0.008)； (3)在PHA刺激下，在RA病人的淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)Bax表達(dá)的免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于對照組(RA：54.15±4.83％vs對照組：60.26±5.26％，p=0.014)；而

9、Bcl-2免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于對照組(RA：58.04±4.72％vs對照組：33.60±4.59％，p=0.000)。 (4)在CD4+CD28-T細(xì)胞比例與活化淋巴細(xì)胞凋亡率之間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示它們存在負(fù)相關(guān)(r=-0.433，p=0.003)； 結(jié)論：(1)RA組CD4+CD28-T細(xì)胞比例的均數(shù)明顯高于健康對照組并與RF滴度間存在一定相關(guān)性，提示CD4+CD28-T細(xì)胞水平與疾病狀況和慢

10、性炎癥相關(guān)。大量的CD4+CD28-T細(xì)胞出現(xiàn)可能引導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變從而參與RA的發(fā)病機(jī)制。(2)RA病人活化的外周血淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡缺陷，并與RA病情活動(dòng)程度相關(guān)。對激活誘導(dǎo)凋亡的易感性的降低可能導(dǎo)致活化的外周淋巴淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增并因此參與在RA外周自我活化T細(xì)胞克隆的維系。(3)在RA病人，發(fā)現(xiàn)活化的外周血淋巴細(xì)胞有Bax表達(dá)降低和Bcl-2表達(dá)增高，提示在RA淋巴細(xì)胞抗凋亡進(jìn)程的發(fā)生以Bcl-2的過度表達(dá)和Bax的低表達(dá)為特