結(jié)直腸癌IGFBP-rP1基因甲基化調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是一類嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。近年來(lái)，隨著化療、放療和生物靶向治療等多種手段的開展，死亡率有所下降，但發(fā)病率仍然很高。在中國(guó)，大腸癌發(fā)病率增長(zhǎng)速度迅猛，尤其是蘇浙滬三地。檢出率低是影響大腸癌早期發(fā)現(xiàn)及治療效果的重要因素之一。因此，因此積極開展結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)于結(jié)直腸癌的防治具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 IGFBP-rP1(insulin-like growth factor binding protein-r

2、elated protein1)是我們實(shí)驗(yàn)室在1999年用抑制性差減雜交法(suppresion subtractive hybridisaTiO2，SSH)構(gòu)建的結(jié)直腸腺癌相對(duì)正常粘膜(T-N)文庫(kù)中篩頻率較高、在腺癌中高表達(dá)的一個(gè)基因。IGFBP-rP1又稱為IGFBP7(Insulin-like growth factor binding protein7)、mac25(meningioma associated cDNA25)、

3、PSF(prostacyclin-stimulating factor),AGM(angiomodulin)和TAF(tumor-derived adhesion factor)。目前認(rèn)為IGFBP-rP1與多種人類腫瘤關(guān)系密切，大部分報(bào)道認(rèn)為IGFBP-rP1在多種人類腫瘤，如腦膜瘤、肺癌、肝癌等中均存在表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌基因的角色。
　　 基因的表達(dá)調(diào)控主要通過(guò)遺傳學(xué)(genetics)和表遺傳學(xué)(e

4、pigenetics）兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)。遺傳學(xué)改變是涉及核苷酸序列改變的機(jī)制，但是目前只能解釋腫瘤發(fā)生機(jī)制中的一部分原因，表遺傳學(xué)機(jī)制是一種不涉及DNA序列變化的可遺傳的基因表達(dá)方式的改變，目前認(rèn)為表遺傳學(xué)是較遺傳學(xué)更為常見的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，許多具有重要功能的基因是通過(guò)表遺傳學(xué)機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。DNA甲基化表遺傳的主要方式，是研究得最深入的作用方式，與抑制基因的表達(dá)有關(guān)，其在腫瘤發(fā)生中的作用是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)

5、室前期對(duì)IGFBP-rP1的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了系列探索性工作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGFBP-rP1基因的啟動(dòng)子區(qū)域和所有5個(gè)外顯子不存在序列突變，遺傳學(xué)改變可能不是其主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。用亞硫酸氫鈉-測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)詳細(xì)研究基因5’端CpG島中所有CpG位點(diǎn)的甲基化情況，在體內(nèi)體外試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中，IGFBP-rP1基因的5’端CpG島存在異常甲基化，并且第一外顯子的異常甲基化水平與該基因的表達(dá)

6、水平呈負(fù)相關(guān)。
　　 研究表明，DNA甲基化主要通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的催化下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基，將胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，從而使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。在人類，DNMTs主要有三種：DNMT1、DNMT3a與DNMT3b。DNMT3a和DNMT3b主要是使未甲基化的位點(diǎn)發(fā)生甲基化（從頭發(fā)生甲基化，de novo methylaTiO2）。DNMT1

7、則維持相關(guān)位點(diǎn)甲基化，并將甲基化信息傳給子代細(xì)胞（維持甲基化，maiitenance methylaTiO2）。5’-Azadc等去甲基化藥物可能通過(guò)抑制DNMTs的活性實(shí)實(shí)去甲基化。
　　 EZH2(enhancers ofzest homologue2)在腫瘤DNA甲基化中的作用最近受到關(guān)注。EZH2是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，也是一個(gè)組蛋白甲基化酶(histonemethyltransferases，HMTs)，屬于Polycom

8、b group(PcG)家族成員，是Polycombrepress complex2/3(PRC2/3)的重要成分。含EZH2的PRC復(fù)合物與H3K27包裝成一個(gè)特別的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能通過(guò)募集DNMTs，調(diào)控基因發(fā)生甲基化。
　　 IGFBP-rP1表達(dá)還與Rb基因狀態(tài)有關(guān)，IGFBP-rP1低表達(dá)的乳腺癌磷酸化RB表達(dá)水平較高。RB基因調(diào)控IGFBP-rP1表達(dá)的確切機(jī)制也不清楚。近來(lái)有研究表明，RB、E2F可通過(guò)調(diào)控原

9、癌基因EZH2的表達(dá)、影響其與DNMT1的結(jié)合來(lái)參與DNA甲基化過(guò)程?；谏鲜鲅芯砍晒?，本課題研究目標(biāo)為明確RB、EZH2和DNMTs在IGFBP-rP1基因在結(jié)直腸癌中甲基化調(diào)控機(jī)制中的作用。
　　 我們利用western-blot和real-time PCR檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO、HT29、SW620和SW480中RB、EZH2和DNMTs表達(dá)情況，結(jié)果在這四株細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)上述基因均有表達(dá)，所以采用RNA干擾(RNA

10、 interference，RNAi)技術(shù)沉默相關(guān)基因后，觀察IGFBP-rP1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)改變情況，并利用BSP法檢測(cè)IGFBP-rP1第一外顯子甲基化狀態(tài)的改變，旨在明確IGFBP-rP1甲基化調(diào)控通路。
　　 鑒于DNMTs在人類細(xì)胞甲基化中的作用，我們將DNMTs作為研究切入點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)在IGFBP-rP1甲基化程度高且表達(dá)陰性的大腸癌RKO細(xì)胞系中分別沉默DNMT1、DNMT3b和DNMT3a，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的

11、單克隆細(xì)胞系，但是我們?cè)谏鲜龌騿为?dú)沉默后并未檢測(cè)到IGFBP-rP1表達(dá)改變。之后我們采取質(zhì)粒共轉(zhuǎn)來(lái)兩兩沉默DNMTs基因，我們發(fā)現(xiàn)在DNMT1和DNMT3b共同干擾的單克隆細(xì)胞系中IGFBP-rP1恢復(fù)了較弱的表達(dá)，染色質(zhì)免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitaTiO2，ChIP)結(jié)果顯示DNMT1蛋白與IGFBP-rP1 DNA第一外顯子直接結(jié)合而DNMT3b未檢測(cè)到與IGFBP-rP1的直接作用。亞硫酸氫鈉-

12、測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)IGFBP-rP1基因第一外顯子甲基化改變情況，明確了DNMT1和DNMT3b共同參與了在IGFBP-rP1的甲基化調(diào)控中。我們還采用了MTT試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了DNMT1和DNMT3b共同干擾可促進(jìn)凋亡和抑制細(xì)胞增殖。結(jié)合IGFBP-rP1表達(dá)改變情況，我們推測(cè)IGFBP-rP1表達(dá)的恢復(fù)很可能參與了DNMT1和DNMT3b表達(dá)共同降低后引起的結(jié)直腸癌RKO細(xì)胞生

13、物學(xué)行為的改變。
　　 接下來(lái)我們研究具有可調(diào)控DNMTs功能的EZH2和RB在IGFBP-rP1甲基化調(diào)控中是否發(fā)揮重要的作用。我們?cè)谟行С聊珽ZH2后并未發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1表達(dá)改變，而RB干擾后IGFBP-rP1有較明顯的恢復(fù)表達(dá)，我們?cè)贗GFBP-rP1陰性表達(dá)的大腸癌細(xì)胞SW620中瞬時(shí)干擾RB也發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1表達(dá)的改變，我們將RB干擾后的RKO細(xì)胞建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞系用于檢測(cè)IGFBP-rP1基因第一

14、外顯子甲基化改變情況。我們同樣采用了MTT試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了該單克隆細(xì)胞株在增殖能力和凋亡的改變，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，RB干擾組凋亡率顯著升高，細(xì)胞增殖能力下降。ChIP結(jié)果未發(fā)現(xiàn)RB與IGFBP-rP1存在直接的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)在RB干擾的單克隆細(xì)胞株中DNMT1和DNMT3b均有明顯下調(diào)，我們推測(cè)RB可能通過(guò)調(diào)控DNMTs家族來(lái)改變IGFBP-rP1基因第一外顯子甲基化情況，進(jìn)而改變IGFBP-rP1表達(dá)。
　　 通