慢性鉛暴露對小鼠學習記憶功能及大腦皮層神經(jīng)元PI3K-PKB信號分子的影響.pdf

1、目的：鉛是環(huán)境中一種具有很強神經(jīng)發(fā)育毒性的毒物，即使是低水平暴露，仍然可以損害發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響兒童的學習記憶能力和神經(jīng)行為。由于兒童血腦屏障發(fā)育不完整，當血鉛水平達到100μg/L時便能導致學習記憶及行為異常，引起兒童不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損害。因此預防和治療兒童鉛中毒是涉及保護我國三億兒童身心健康以及保證我國人民子孫后代富國強民的大事。目前鉛致神經(jīng)中毒機制仍不清楚。 蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)與

2、蛋白激酶A和蛋白激酶C高度同源。因其與人類病毒癌基因V—Akt高度同源，故名Akt。PKB/Akt途徑可激活多種底物，調(diào)節(jié)細胞的生存、分化、增殖和代謝等[1]。Erin等報道PKB/Akt也參與神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的存活、分化、凋亡等[2]。有研究指出[3]PI3K激活下游的PKB/Akt等參與海馬CA1區(qū)LTP的表達，而與LTP的誘導無關。LTP表達是以AMPA受體功能持續(xù)增強為特點的。而且PI3K能促進膜上AMPA受體的功能加強與受體數(shù)

3、量增加。PI3K是第一個發(fā)現(xiàn)的影響LTP表達的因子，為此其作用備受關注。 鉛是環(huán)境中一種主要的、具有很強神經(jīng)發(fā)育毒性的毒物，即使是低水平暴露，仍然可以損害發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響人類的學習記憶能力和神經(jīng)行為[4]。研究指出，多種蛋白激酶參與學習記憶過程。鉛對小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞PKB表達的影響未見報導。 本課題建立染鉛小鼠動物模型，觀察不同濃度鉛對小鼠記憶行為(水迷宮、跳臺試驗)的影響；觀察不同濃度鉛對小鼠皮層神經(jīng)元

4、PI3K/PKB信號分子表達的影響，探討PI3K/PKB信號分子與鉛致神經(jīng)系統(tǒng)學習記憶功能異常的關系，為探討PI3K/PKB信號分子在神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的代謝、存活、分化、增殖、凋亡及LTP中的作用機制奠定基礎。 方法：昆明系小鼠由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按每籠雄：雌為1：2自然交配，隨機分為五組，依次分為對照組和2.4、4.8、7.6、9.mmol/L醋酸鉛組。從出生第一天起開始通過飲水飼以不同濃度醋酸鉛水溶液。對照組飲用

5、自來水。低、中、高劑量鉛中毒組飲用含2.4、4.8、7.6、9.6mmol/L醋酸鉛水溶液。自第21d起，幼鼠開始自己飲用與其母鼠相同的飲用水。于出生后第42d解剖動物取出大腦皮層，放入液氮中，轉存到—70℃冰箱中。第42d開始進行水迷宮和跳臺實驗，觀察鉛對小鼠學習記憶功能的影響。 取對照組與染鉛組小鼠大腦皮層標本，利用PI3K和PKB多克隆抗體，經(jīng)Western blot方法測定PI3K和PKB在皮層神經(jīng)元的表達。證明鉛是通過

6、影響P13K和PKB表達而學習記憶功能的，為揭示老年癡呆癥等發(fā)病機制提供新的研究方向。 結果： 1、慢性鉛暴露對小鼠血鉛和腦鉛含量的影響 小鼠出生后42d進行血鉛和腦鉛含量進行測定，各慢性染鉛組小鼠血鉛和腦鉛含量均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，升高的程度與飲用水的鉛濃度呈正相關。9.6mmol/L醋酸鉛組明顯高于2.4mmol/L醋酸鉛組。差異有統(tǒng)計學意義。 2、慢性鉛暴露損傷小鼠空間

7、學習記憶及被動回避反應學習記憶能力 在水迷宮實驗中，結果表明慢性鉛暴露可明顯損傷小鼠的空間學習記憶能力，損傷程度與飲用鉛的濃度成正相關； 在跳臺試驗中，結果表明慢性鉛暴露可明顯損傷小鼠的被動回避反應的獲得與保持能力，其損傷程度亦與飲用鉛的濃度成正相關。 3、慢性鉛暴露對小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞PI3K/PKB信號分子的影響 蛋白免疫印跡檢測結果顯示：4.8、9.6mmol/L醋酸鉛組鼠腦海馬PI3K蛋白的表

8、達與相應期對照組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Pearson相關分析顯示，PI3K表達與血鉛濃度呈負相關(γ=-0.82，P<0.01)，即血鉛、腦鉛的濃度越高，PI3K表達降低越明顯。PI3K表達與學習記憶能力損傷程度比較呈負相關(r=-0.671，P<0.01)，即p-PKB表達降低越明顯，損傷程度越嚴重。 與對照組相比，染鉛組的總量PKB蛋白(t-PKB)與對照組相比無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。染鉛組p-P

9、KB表達有顯著性降低(P<0.01)，并呈濃度依賴性。染鉛組的總量PKB蛋白與對照組相比無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Pearson相關分析顯示，p-PKB表達與血鉛濃度呈負相關(γ=-0.82，P<0.01)，即血鉛、腦鉛的濃度越高，p-PKB表達降低越明顯。p-PKB表達與學習記憶能力損傷程度比較呈負相關(γ=-0.671，P<0.01)，即p-PKB表達降低越明顯，損傷程度越嚴重。 結論： 1、慢性染鉛使小鼠血

10、鉛和腦鉛含量均明顯高于對照組，升高的程度與飲用水的鉛濃度呈正相關。 2、慢性鉛暴露可明顯損傷小鼠的空間學習記憶能力。學習記憶能力損傷程度與血鉛、腦鉛的濃度呈正相關，即隨血鉛、腦鉛的濃度升高，空間學習記憶損傷程度越嚴重。 3、慢性鉛暴露導致小鼠大腦皮層神經(jīng)元PI3K、p-PKB的表達降低，而不影響t-PKB的表達。慢性鉛暴露時PI3K/PKB信號轉導途徑表達降低，進而損傷LTP，導致學習功能異常。這可能是鉛致小鼠學習記憶功