臍血內(nèi)皮祖細胞糖基化修飾及其在缺血性動物模型的應用.pdf

1、目的：
　　周圍血管疾病是威脅人類健康的世界難題，長期組織血流灌注不足可引起缺血性潰瘍和壞疽，最終導致三分之一以上的病人截肢。自1997年以來，循環(huán)內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）參與的血管生成被認為是出生后血管發(fā)生的重要機制?；谶@一認識，細胞基礎的針對損傷血管的修復得到廣泛的研究。EPCs定向歸巢到缺血壞死組織的第一步是EPCs在缺血部位的滾動粘附，這是由P-選擇素
　　

2、（P-selectin）和E-選擇素（E-selectin）與其共同的配體P-選擇素糖蛋白配體（P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1）的相互作用完成的。研究發(fā)現(xiàn)，大約25%的臍血CD34+造血干細胞表面的PSGL-1不能有效地與P-選擇素以及E-選擇素結合。由于EPCs與CD34+造血干細胞來源于同一前體細胞-成血管細胞，因此，我們假設EPCs具有同樣的不足，如果我們能夠修正這一功能缺陷，將會

3、促進EPCs歸巢至血管形成部位，從而為增強干細胞的治療效果提供了一種新的有效的治療策略。
　　方法：
　　1.通過密度梯度離心法從臍血中分離出單核細胞層（mononuclear cells, MNCs），通過免疫磁珠方法分離純化CD34+細胞，將純化的CD34+細胞接種于含EGM-2培養(yǎng)基的人纖維連接蛋白（fibronectin, FN）包被的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)及體外擴增。
　　2.通過流式細胞術檢測臍血EPCs表面分子

4、的表達，如CD133、CD31、CD34、CD144、VEGFR2、CD105、CD146、CD14和CD45。
　　3.通過逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）分析臍血EPCs特異基因的表達。
　　4.通過免疫熒光技術分析血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）、CD31、CD144在細胞中的表達

5、。
　　5.分析所培養(yǎng)細胞對乙?；兔芏戎鞍祝ˋcetylated LDL, Ac-LDL）的攝取能力及體外成血管能力。
　　6.將巖藻糖基轉移酶VI（a1,3-fucosyltransferase VI, FucT VI）質粒轉染至EPCs中，并通過Western blot方法對巖藻糖基轉移酶蛋白的表達進行鑒定。
　　7.使用特異性識別人唾液酸化的路易斯寡糖（sialyl Lewis X, sLex）結構的抗體HE

6、CA-452，通過流式細胞術分析轉染FucT VI表達質粒及轉染空載體質粒的EPCs表面sLex的表達變化。
　　8.流式細胞儀檢測轉染FucT VI表達質粒及對照質粒的EPCs與P-選擇素和E-選擇素的結合能力變化。
　　9.檢測FucT VI質粒轉染組及空載體質粒轉染組的EPCs與經(jīng)腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-alpha, TNF-α）處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（human umbilic

7、al vein endothelial cell, HUVEC）的粘附能力。
　　10.建立聯(lián)合免疫缺陷小鼠下肢缺血模型，將體外標記的FucT VI質粒轉染組
　　EPCs及空載體質粒轉染組EPCs通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，并檢測其向缺血部位的歸巢。
　　11.建立聯(lián)合免疫缺陷小鼠下肢缺血模型，將試驗小鼠隨機分為3組：生理鹽水組、EPCs未經(jīng)過糖化處理組、EPCs糖基化處理組。將細胞或生理鹽水通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，

8、通過多普勒超聲檢測三組小鼠的血流恢復情況，通過H&E染色評價小鼠的微脈管結構，通過免疫熒光技術檢測小鼠的下肢缺血部位毛細血管密度。
　　結果：
　　1.通過密度梯度離心法和免疫磁珠法篩選出的CD34+細胞，接種于FN包被的培養(yǎng)皿中，靜置48小時后，可見數(shù)個散在的細胞集落，鵝卵石樣集落于一周左右出現(xiàn)。
　　2.通過流式細胞術對所培養(yǎng)的EPCs進行鑒定，結果CD133、CD31、CD34、CD144、VEGFR2、CD10

9、5和CD146的表達均為陽性，CD14及CD45的表達為陰性，符合EPCs的表型特征。
　　3.通過RT-PCR對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定，結果EPCs的特異基因，如CD31、CD34、CD144、VEGFR-2和vWF，均有表達。
　　4.通過免疫熒光技術檢測所培養(yǎng)EPCs的表型，結果CD31、CD144及vWF的表達均為陽性，符合EPCs的表達特征。
　　5.所培養(yǎng)細胞具有EPCs的特征，具有攝取DiI標記的Ac-LD

10、L的能力和體外成血管能力。
　　6.將FucT VI質粒轉染至EPCs中，48小時后通過Western blot檢測到FucT VI蛋白在EPCs中表達。
　　7.使用特異性識別人sLex結構的抗體HECA-452，通過流式細胞術比較轉染FucT VI表達質粒及轉染空載體質粒的EPCs表面sLex的表達差異，結果FucT VI質粒轉染組sLex的陽性表達率約89.93%±2.13，空載體質粒轉染組sLex的陽性表達率約5.2

11、9%±1.25，兩組比較p<0.01。
　　8.通過流式細胞術比較FucT VI質粒轉染組與空載體質粒轉染組與P-選擇素和E-選擇素的結合能力差異，結果FucT VI質粒轉染組與P-選擇素結合率為87.61%±2.37，與E-選擇素結合率為83.44%±3.11；空載體質粒轉染組與P-選擇素結合率為8.56%±1.17，與E-選擇素結合率為3.11%±0.89。由此可見，F(xiàn)ucT VI質粒轉染組與P-選擇素和E-選擇素的結合能力較

12、空載體質粒轉染組明顯增強。
　　9. FucT VI質粒轉染組EPCs與TNF-α刺激后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的粘附能力是空載體質粒轉染組粘附能力的1.3倍。
　　10.建立聯(lián)合免疫缺陷小鼠下肢缺血模型，將體外標記的FucT VI質粒轉染組及空載體質粒轉染組的EPCs通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，三天后收集下肢缺血側肌肉，結果在熒光顯微鏡下觀察到缺血部位EPCs的粘附，且在缺血部位EPCs的粘附FucT VI質粒轉染組

13、為空載體質粒轉染組的轉染組的2.44倍，p<0.01。
　　11.在缺血后14天通過激光多普勒超聲檢測三組小鼠下肢血流情況，結果顯示糖基化處理組缺血側/對照側的血流灌注比值較未糖基化處理組升高34%，未糖基化處理組較生理鹽水組升高42%，糖基化處理組較生理鹽水組升高90%，三組之間的差異均有統(tǒng)計學意義。缺血側下肢肌肉組織H&E染色顯示糖基化處理組微脈管結構再生強于未糖基化處理組，未糖基化處理組強于生理鹽水組。免疫熒光檢測缺血側下肢

14、肌肉毛細血管密度，結果糖基化處理組毛細血管密度為未糖基化處理組1.57倍，未糖基化處理組毛細血管密度為生理鹽水組1.75倍，三組之間的差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。
　　結論：
　　首先我們從臍血中分離和培養(yǎng)出了 EPCs，研究發(fā)現(xiàn)臍血來源的 EPCs存在PSGL-1糖基化缺陷，通過體外糖基化修飾恢復了EPCs的PSGL-1功能后，經(jīng)體外實驗和體內(nèi)動物模型證實了糖基化修飾后 EPCs的治療效果。此研究發(fā)現(xiàn)為促進 EPC