基于寡核苷酸芯片的地中海貧血特異性DNA甲基化的研究.pdf

1、地中海貧血是一組由于血紅蛋白的珠蛋白肽鏈(α、β、γ)的合成抑制、失衡,引起無效造血和溶血性貧血。目前,對于這類疾病尚無有效的治療方法,只能通過遺傳篩查及產(chǎn)前診斷選擇性的淘汰地貧患兒以控制這類疾病的發(fā)生和傳播。傳統(tǒng)診斷地中海貧血的方法實(shí)驗(yàn)周期長,且只能診斷臨床上常見的幾種基因缺失或點(diǎn)突變所引起的地中海貧血。因此,迫切需要尋求一種新的具有組織特異性的分子靶標(biāo),為地中海貧血的診斷提供新途徑。
　　 目前,在應(yīng)用于這種高度異質(zhì)性遺傳病

2、的各種分子診斷方法中,快速簡便的基因芯片技術(shù)引人注目。因?yàn)?常規(guī)的基因和蛋白質(zhì)組學(xué)的已不能滿足臨床的需要,尤其對于反復(fù)妊娠發(fā)病的或者輕型的地中海貧血患者而言,傳統(tǒng)的分子診斷方法不能檢測到基因突變或片段缺失,對于這部分病例,經(jīng)典的遺傳學(xué)理論無法解釋其發(fā)病機(jī)制。表觀遺傳學(xué)的進(jìn)展,為地中海貧血尋求和發(fā)現(xiàn)新的更簡便、更精確、易于推廣的診斷方法,提供了可能。
　　 表觀遺傳學(xué)是與遺傳學(xué)(genetic)相對應(yīng)的概念,指的是基于非基因序列改

3、變所致的基因表達(dá)水平變化,如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。從目前的研究來看,X染色體劑量補(bǔ)償、DNA甲基化、組蛋白密碼、基因組印記、表觀基因組學(xué)和人類表觀基因組計(jì)劃等問題都是表觀遺傳學(xué)研究的內(nèi)容。有文獻(xiàn)報(bào)道,在任何時(shí)候,細(xì)胞內(nèi)都有處于活化狀態(tài)的基因和失活狀態(tài)的基因。在發(fā)育過程的不同時(shí)期發(fā)生不同類型的基因轉(zhuǎn)錄。有關(guān)地中海貧血在表觀遺傳學(xué)甲基化修飾的研究雖有報(bào)道,但既不系統(tǒng)又未起到指導(dǎo)臨床診斷作用。隨著DNA甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展和完善,通

4、過尋找受甲基化調(diào)控的新位點(diǎn)來診斷和治療疾病已經(jīng)逐漸成為相關(guān)腫瘤和遺傳病的分子診斷和治療的手段之一。文獻(xiàn)報(bào)道,在珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄、發(fā)育調(diào)控過程中,DNA甲基化起著關(guān)鍵作用。以分子雜交為基礎(chǔ)的微陣列技術(shù)應(yīng)用于DNA甲基化檢測中,這種方法是基于雜交的寡核苷酸微陣列,是一種在基因組中尋找新位點(diǎn)的方法。通過這種高通量的方法,我們可以找到基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化的基因位點(diǎn)。目前為止,通過微陣列芯片技術(shù)檢測單基因遺傳病地中海貧血鮮有報(bào)道。受此啟發(fā),本研究

5、擬通過DMH甲基化芯片技術(shù)分析地中海貧血中相關(guān)分子的表觀遺傳學(xué)甲基化修飾規(guī)律和特點(diǎn),以期能尋求和發(fā)現(xiàn)新的診斷地中海貧血的方法,提高地中海貧血的早期診斷率和篩查準(zhǔn)確率,為臨床早期篩查和診斷地中海貧血胎兒開拓新途徑。
　　 本課題由三部分組成,即建立DNA甲基化芯片平臺;應(yīng)用已成熟的基因表達(dá)譜芯片進(jìn)一步篩選基因組地中海貧血新的位點(diǎn),利用甲基化特異PCR(MSP)驗(yàn)證芯片結(jié)果并探討甲基化差異位點(diǎn)與地中海貧血相關(guān)性;通過Sequenom

6、甲基化質(zhì)譜測序平臺對IGSF4基因啟動(dòng)子區(qū)測序,觀察IGSF4基因在地中海貧血中的甲基化狀態(tài),并探討其與地中海貧血發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.DNA甲基化芯片模型建立,DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成。
　　 2.通過DMH芯片及其MAS系統(tǒng)的功能分類共發(fā)現(xiàn)11條與血液病及遺傳病直接相關(guān)的有甲基化變化基因,分別為CBFB、HDAC3、IL12A、PLAT、RTKN、RAD52、PTGS1、D

7、GUOK、MRE11A和THRA(ratio＞2.0)。
　　 3.基因LARP2、HDAC3、THRA在β-地中海貧血中呈高度甲基化狀態(tài)(ratio＞2.0),提示LARP2、HDAC3、THRA的高度甲基化可能成為表觀遺傳學(xué)上調(diào)控β-珠蛋白的機(jī)制之一。
　　 4.經(jīng)MassARRAY甲基化質(zhì)譜測序方法對23例地中海貧血和5例正常對照血樣對比分析,結(jié)果顯示,被檢測的IGSF4啟動(dòng)子區(qū)12個(gè)CpG位點(diǎn)在地中海貧血中相對于

8、正常外周血甲基化程度明顯增高,呈高度甲基化狀態(tài)(P＜0.01),提示IGSF4基因的高度甲基化可能成為導(dǎo)致地中海貧血的機(jī)制之一。
　　 5.表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示表達(dá)上調(diào)基因共有159個(gè),下調(diào)基因共有92個(gè)。通過MAS系統(tǒng)分析得到與IGSF4途徑相關(guān)的基因位點(diǎn)CSF1、CSF2、TPO、HBB、HBD、HBA和CBLC與正常外周血相比呈表達(dá)下調(diào)(ratio＜0.50);CD45、AZU1和IL1B呈表達(dá)上調(diào)(ratio＞2.