暗紋東方鲀體內(nèi)細(xì)菌類(lèi)群組成分析及產(chǎn)河鲀毒素菌株的篩選.pdf

1、關(guān)于河鲀魚(yú)體內(nèi)河鲀毒素的起源，至今為止仍無(wú)定論。近二十年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)寄生于魚(yú)體內(nèi)的部分細(xì)菌被證實(shí)能夠產(chǎn)河鲀毒素。許多研究者認(rèn)為這些細(xì)菌主要是通過(guò)食物鏈進(jìn)入魚(yú)體。為了了解餌料對(duì)魚(yú)體內(nèi)細(xì)菌組成的影響，本文以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉?duì)象，通過(guò)對(duì)投喂不同餌料的魚(yú)體部分組織腸道、表皮、性腺和肝臟中細(xì)菌類(lèi)群組成分析，并對(duì)其中特異的弧菌組成作了進(jìn)一步分析，來(lái)探討?zhàn)D料對(duì)各組織內(nèi)細(xì)菌類(lèi)群組成影響。然后試圖通過(guò)分離到產(chǎn)河鲀毒素細(xì)菌，為今后研究河鲀毒素產(chǎn)生機(jī)制作

2、基礎(chǔ)。本文在研究魚(yú)體內(nèi)細(xì)菌組成時(shí)采用PCR-DGGE分子生物學(xué)策略以分析16SrDNA特征序列對(duì)細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行鑒定，并結(jié)合培養(yǎng)、未培養(yǎng)的細(xì)菌類(lèi)群組成差異進(jìn)行分析。主要研究結(jié)果如下： 1.暗紋東方鲀的腸道、表皮、性腺和肝臟組織的細(xì)菌組成。共得到80種不同細(xì)菌，其中未經(jīng)培養(yǎng)而直接來(lái)源于組織樣品的細(xì)菌為34種；經(jīng)選擇性培養(yǎng)基PCA、TCBS培養(yǎng)后的混合細(xì)菌中共獲得49種，其中3種與未培養(yǎng)的完全一致。在對(duì)直接來(lái)源于組織中的34種不同細(xì)菌的

3、16SrDNA特征序列分析，結(jié)果表明，占優(yōu)勢(shì)的是γ亞群的變形細(xì)菌(γ-Proteobacteria)，共17種，占50％；其次為低G+C含量的G+細(xì)菌，8種，占23.5％；CFB類(lèi)僅3種，占8.8％；此外，α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、螺旋體類(lèi)及高G+C含量的G+細(xì)菌各1種；而培養(yǎng)后的細(xì)菌幾乎都是γ-Proteobacteria類(lèi)細(xì)菌，僅在TCBS培養(yǎng)基上獲得5株低

4、G+C含量的G+細(xì)菌。其中腸道內(nèi)未經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)菌主要有：低G+C含量的G+細(xì)菌(6種，占46％，歸屬于芽孢桿菌屬、乳球菌屬、肉桿菌屬和毛球菌屬)、γ-Proteobacteria(4種，占31％，歸屬于希瓦菌屬和弧菌屬)以及ε-Proteobacteria、β-Proteobacteria和螺旋體類(lèi)；表皮中含有：γ-Proteobacteria(10種，占55.6％，歸屬于氣單胞菌屬、希瓦菌屬、假交替單胞菌屬以及假單胞菌屬等)、CFB類(lèi)細(xì)

5、菌(3種，占16.7％，歸屬于擬桿菌綱和黃桿菌科)、低G+C含量的G+細(xì)菌的乳桿菌屬(2種)以及各1種的α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和高G+C含量的G+細(xì)菌的考克氏菌屬；性腺和肝臟組織中，γ-Proteobacteria(13種，占52％，分別歸屬于沙雷菌屬、弧菌屬、希瓦菌屬、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等)、低G+C含量的G+細(xì)菌(7種，占28％，集中在芽孢桿菌屬、乳球菌屬、肉桿菌屬和乳

6、桿菌屬)、CFB類(lèi)的黃桿菌科細(xì)菌以及α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和高G+C含量的G+細(xì)菌。 不同組織間細(xì)菌類(lèi)群差別，腸道與性腺肝臟組織及表皮中細(xì)菌組成差別較大，而后兩者之間差別不大。主要表現(xiàn)在腸道中含有特有的ε-變形細(xì)菌和螺旋體類(lèi)細(xì)菌，但是，未分離到CFB類(lèi)和高G+C含量的G+細(xì)菌。 2.不同餌料喂養(yǎng)的暗紋東方鲀的腸道、表皮、性腺和肝臟組織的細(xì)菌組成的差別。腸道內(nèi)以天然餌料鮮活魚(yú)蝦飼

7、養(yǎng)的暗紋東方鲀(N組)與人工餌料飼養(yǎng)的暗紋東方鲀(C組)差別較明顯：N組包含乳球菌屬、肉桿菌屬、芽孢桿菌屬、希瓦菌、弧菌以及α-Proteobacteria和β-Proteobacteria類(lèi)細(xì)菌；而C組則包括螺旋體、低G+C含量的G+細(xì)菌毛球菌屬、ε-Proteobacteria和弧菌屬。性腺和肝臟、表皮內(nèi)差別不是很顯著。 3.不同餌料喂養(yǎng)的暗紋東方鲀的腸道、表皮、性腺組織的弧菌組成。共鑒定出暗紋東方鲀體內(nèi)18種細(xì)菌，其中7種

8、為未培養(yǎng)細(xì)菌類(lèi)特有的，約占39％。所有細(xì)菌均歸屬于變形細(xì)菌(Proteobacteria)的gamma亞群，其中13種為弧菌科細(xì)菌，3種為腸桿菌科細(xì)菌，2種為氣單胞菌屬細(xì)菌。經(jīng)不同飼料喂養(yǎng)的河鲀各組織的細(xì)菌組成的差異性，腸道最大，性腺次之，表皮最小。 4.產(chǎn)河鲀毒素細(xì)菌分離。從暗紋東方鲀腸道等組織中共分離到30株單菌落，經(jīng)初步檢測(cè)，證明菌株Ne3能夠產(chǎn)河鲀毒素。通過(guò)對(duì)Ne3菌株的部分生物學(xué)特征鑒定并結(jié)合16SrDNA全長(zhǎng)序列的遺