桂苓消異方含藥血清對子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細胞凋亡及NF-κB活性的影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的良性婦科病變，其特征在于子宮內(nèi)膜的腺上皮細胞和基質(zhì)細胞存在于子宮腔以外的部位，臨床上常見的部位有卵巢、輸卵管、膀胱、子宮肌層等。它所引起的痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕等嚴重影響了中青年婦女的健康和生活質(zhì)量，也日益受到人們的關(guān)注。因其發(fā)病機制未明，治療的針對性不強，該病的診治依然困擾著婦產(chǎn)科的專家學者們。
　　本實驗通過體外分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞來研究桂苓消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥的微觀作用機理，通過制備藥物血

2、清了解桂苓消異方對體外培養(yǎng)的基質(zhì)細胞形態(tài)、細胞早期凋亡及細胞NF-κB的活性的作用。由于已有證據(jù)表明桂苓消異方對體外培養(yǎng)的內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞上清液中表達的IL-8有抑制作用[1]，本實驗以此為基礎(chǔ)進一步研究IL-8的表達是否會受基質(zhì)細胞NF-κB活性的影響，以探討桂苓消異方含藥血清能否通過降低NF-κB的活性來抑制IL-8的分泌，為臨床上此方治療子宮內(nèi)膜異位癥提供理論支持。
　　1、桂苓消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥的中醫(yī)

3、理論基礎(chǔ)
　　中醫(yī)學古籍中并未記載子宮內(nèi)膜異位癥病名，將其歸于“痛經(jīng)”、“不孕”、“癥瘕”、“月經(jīng)不調(diào)”等范疇。目前多數(shù)學者認為此病的治療應(yīng)當從溫腎化瘀著手，腎虛是發(fā)生本病的根本，血瘀是其重要的致病因素和病理表現(xiàn)。
　　桂苓消異方是導(dǎo)師在張仲景《金匱要略》中記載的桂枝茯苓丸基礎(chǔ)上去蜂蜜，加仙靈脾、血竭粉而成。桂枝茯苓丸本來是用于治療妊娠之后癥積害胎者，導(dǎo)師加用仙靈脾和血竭粉增強了原方溫腎、祛瘀的力量，臨床觀察此方用于內(nèi)異癥的

4、治療效果顯著。本課題用桂苓消異方含藥血清對人子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細胞進行體外研究，為桂苓消異方的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
　　2、分離純化體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞
　　收集2011年9月至2012年5月因子宮內(nèi)膜異位癥在揚州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科采取手術(shù)治療的患者的在位子宮內(nèi)膜作為實驗組，同時收集診斷為非內(nèi)異癥且開腹或腹腔鏡術(shù)后病理提示為正常的內(nèi)膜作為對照組，兩組內(nèi)膜術(shù)后病理提示分別為內(nèi)異癥和正常子宮內(nèi)膜。對收集的內(nèi)膜標本

5、分離培養(yǎng)基質(zhì)細胞，視細胞生長情況進行傳代，并利用免疫組化法鑒定細胞純度。根據(jù)經(jīng)驗，選取術(shù)前B超提示內(nèi)膜厚度至少為5mm的患者作為采集對象。
　　結(jié)果顯示，在現(xiàn)有的實驗條件下并結(jié)合參考查閱文獻，以膠原酶消化、篩網(wǎng)分離為主要實驗方法，人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)及傳代情況良好。實驗觀察基質(zhì)細胞可傳4-5代，傳代后的細胞活性及生長情況未因傳代受明顯影響。通過實驗后統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在本實驗條件下內(nèi)異癥與非內(nèi)異癥內(nèi)膜均可分離培養(yǎng)成功，取材時內(nèi)

6、膜所處的月經(jīng)周期對細胞的成活率無明顯影響。成功分離培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞為下一步的實驗提供了良好的平臺。
　　3、桂苓消異方對子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細胞早期凋亡的影響
　　制備桂苓消異方藥物血清，同時設(shè)空白組和西藥對照組，用藥物血清干預(yù)內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，觀察藥物影響下細胞的形態(tài)變化，并在檢測細胞凋亡前收集24、48、72h三個時間段細胞培養(yǎng)的上清液，留待下一步檢測;流式細胞儀技術(shù)檢測不同血清濃度對子宮內(nèi)膜

7、異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細胞作用24、48、72h后細胞早期凋亡的影響。
　　4、子宮內(nèi)膜異位癥中NF-κB、IL-8的相關(guān)性探討及桂苓消異方對內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜基質(zhì)細胞NF-κB活性的影響
　　用不同濃度的TNF-α，TNF-α+PDTC干預(yù)原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細胞，觀察細胞形態(tài)的變化，并收集培養(yǎng)24h后的細胞培養(yǎng)上清液，通過ELISA法檢測上清液中NF-κB活性、IL-8濃度，利用統(tǒng)計學方法分析兩者之間的相關(guān)

8、性。
　　ELISA法檢測上一步實驗中收集的藥物血清作用后的內(nèi)異癥患者基質(zhì)細胞上清液中的NF-κB活性。
　　通過ELISA定量檢測表明，在經(jīng)TNF-α，TNF-α+PDTC處理過的內(nèi)異癥基質(zhì)細胞上清液中IL-8的表達與NF-κB的活性具有相關(guān)性，說明子宮內(nèi)膜異位癥中的IL-8的表達可能與NF-κB途徑相關(guān);同時檢測的數(shù)據(jù)表明桂苓消異方含藥血清能降低內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞上清液中的NF-kB的活性。因前期研究已表明桂