基于HK-2細(xì)胞評(píng)價(jià)藥物腎毒性體外方法的建立.pdf

1、目的:本研究擬采用人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2),觀察藥物對(duì)HK-2細(xì)胞的毒效應(yīng),并檢測(cè)藥物對(duì)其相應(yīng)毒性指標(biāo)及腎損傷指標(biāo)的影響,確立特異性評(píng)價(jià)藥物腎毒性的體外檢測(cè)指標(biāo),建立一種基于HK-2細(xì)胞評(píng)價(jià)藥物腎毒性的體外方法,應(yīng)用于藥物腎毒性的早期預(yù)測(cè),為新藥研發(fā)早期腎毒性評(píng)價(jià)與篩選提供技術(shù)方法。
　　方法:
　　1.用單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(MTS法)測(cè)定HK-2及人正常肝細(xì)胞(Human liver cell line,L-0

2、2)在不同接種密度條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線,選擇適當(dāng)吸光度值的接種密度,進(jìn)一步建立細(xì)胞培養(yǎng)6d的生長(zhǎng)曲線,確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。
　　2.在確定了HK-2及L-02細(xì)胞接種密度及培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步以腎毒性藥物慶大霉素、順鉑以及環(huán)孢素A為陽(yáng)性工具藥,同時(shí)以沒(méi)有腎毒性的肝毒性藥物硫唑嘌呤為陰性參照,MTS法測(cè)定四種藥物分別對(duì)HK-2及L-02細(xì)胞活率的影響,并以細(xì)胞活率數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),根據(jù)不同濃度藥物導(dǎo)致細(xì)胞活率變化的曲線采

3、用IC50計(jì)算軟件線性回歸進(jìn)行擬合求出細(xì)胞在體外培養(yǎng)模型中出現(xiàn)10％活率抑制的藥物濃度,將IC10作為我們對(duì)比藥物器官選擇性的依據(jù),驗(yàn)證HK-2細(xì)胞用于藥物腎毒性體外研究的可行性。
　　3.以慶大霉素、順鉑、環(huán)孢素A及硫唑嘌呤作用于體外培養(yǎng)的HK-2及L-02細(xì)胞株,考察四種藥物對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性效應(yīng):倒置相差顯微鏡觀察給藥24h后HK-2細(xì)胞形態(tài),MTS法檢測(cè)藥物對(duì)HK-2細(xì)胞的存活情況,AO/EB熒光染色法觀察藥物對(duì)HK-2

4、細(xì)胞的凋亡情況;采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)HK-2及L-02細(xì)胞培養(yǎng)上清中相應(yīng)毒性指標(biāo)LDH、ALT、AST、ALP、γ-GT的變化,通過(guò)對(duì)比兩種細(xì)胞中肝腎毒性藥物反映細(xì)胞毒性的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)尋找特異反映藥物腎毒性的指標(biāo)。
　　4.N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是一種位于溶酶體內(nèi)的酸性水解酶,主要分布于皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)近曲腎小管受到損傷時(shí),尿中NAG的活性顯著增高,且較其他酶的增高更早出現(xiàn),測(cè)定NAG對(duì)腎小管損害的早期診斷有

5、較大的價(jià)值。腎損傷分子-1(KIM-1)作為一種腎小管損傷的生物標(biāo)志物,是一種1型跨細(xì)胞膜蛋白,在正常組織中表達(dá)非常低,但在腎損傷時(shí)會(huì)在去分化的腎近曲小管上皮細(xì)胞中高度表達(dá)。本研究在已完成的KIM-1可早期預(yù)測(cè)藥物造成腎損傷體內(nèi)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步驗(yàn)證其體外分泌情況是否與體內(nèi)試驗(yàn)一致,驗(yàn)證其是否可以作為體外評(píng)價(jià)藥物腎毒性的檢測(cè)指標(biāo)。以人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)作為研究對(duì)象,采用體內(nèi)試驗(yàn)中所用的慶大霉素、順鉑、環(huán)孢素A作為受試藥物,同時(shí)

6、加入一種沒(méi)有腎毒性的肝毒性藥物硫唑嘌呤作為陰性參照,底物顯色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的釋放,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中腎損傷分子-1(KIM-1)的分泌,重點(diǎn)比較腎損傷標(biāo)志物NAG、KIM-1與動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果、細(xì)胞毒性指標(biāo)的差異,對(duì)其體內(nèi)外相關(guān)性及其作為體外腎毒性指標(biāo)的特異性和敏感性進(jìn)行確證性研究。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)HK-2及L-02細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞數(shù),繪制兩種細(xì)胞培

7、養(yǎng)6d的生長(zhǎng)曲線,選擇進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)迅速的接種密度,以保證細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)最佳狀態(tài),減少由于細(xì)胞自身狀態(tài)的差異所造成的誤差。兩種細(xì)胞均選擇了5000cells/孔的接種密度和24h的培養(yǎng)時(shí)間。
　　2.通過(guò)比較四種藥物的IC10值發(fā)現(xiàn),3種腎毒性藥物慶大霉素、順鉑以及環(huán)孢素A的IC10HK-2值均小于IC10L-02,而硫唑嘌呤作為肝毒性藥物其IC10HK-2值則大于IC10L-02,說(shuō)明:HK-2細(xì)胞對(duì)腎毒性藥物比較敏感,結(jié)合L

8、-02細(xì)胞能夠很好地反映藥物在各器官毒性的差異性,能夠在體外正確地反映藥物腎毒性的大小,將該細(xì)胞模型應(yīng)用于藥物腎毒性的體外評(píng)價(jià)與篩選是可行的。
　　3.從細(xì)胞的形態(tài)、存活、凋亡等三個(gè)方面考察了藥物對(duì)HK-2細(xì)胞的毒效應(yīng),并通過(guò)對(duì)比四種藥物所致HK-2及L-02細(xì)胞上清中相應(yīng)毒性指標(biāo)的變化,確定了LDH及AST可作為反映細(xì)胞毒性的非特異性指標(biāo)、γ-GT可作為特異反映藥物腎毒性的指標(biāo),為藥物的體外腎毒性評(píng)價(jià)提供檢測(cè)依據(jù),進(jìn)而用于藥物腎

9、毒性的評(píng)價(jià)與篩選。
　　4.以人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)作為研究對(duì)象,采用體內(nèi)試驗(yàn)中所用的慶大霉素、順鉑、環(huán)孢素A作為受試藥物,同時(shí)加入一種沒(méi)有腎毒性的肝毒性藥物硫唑嘌呤作為陰性參照,考察了不同梯度濃度藥物對(duì)HK-2細(xì)胞分泌NAG、KIM-1的量效關(guān)系,發(fā)現(xiàn)不同濃度三種腎毒性藥物作用于HK-2細(xì)胞24h后,在藥物較低濃度時(shí)即可刺激HK-2細(xì)胞中NAG、KIM-1分泌水平的升高,與體內(nèi)試驗(yàn)中此三種藥物誘導(dǎo)的大鼠損傷模型尿中NAG、

10、KIM-1明顯升高的結(jié)果一致,這表明NAG、KIM-1作為體外腎毒性指標(biāo)與體內(nèi)結(jié)果具有很好的相關(guān)性。而肝毒性藥物硫唑嘌呤作為陰性參照,在作用于HK-2細(xì)胞24h后未引起HK-2細(xì)胞中KIM-1的分泌出現(xiàn)顯著性升高,唯有腎毒性的藥物在體外可以引起HK-2細(xì)胞KIM-1的顯著分泌,說(shuō)明KIM-1在體外的腎損傷評(píng)價(jià)中具有很好的特異性。而N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是細(xì)胞內(nèi)溶酶體釋放的一種酸性水解酶,在四種藥物作用HK-2細(xì)胞24h后

11、其活性均出現(xiàn)了顯著性升高,說(shuō)明其特異性較KIM-1低,但其仍可作為體外評(píng)價(jià)藥物腎毒性很好的輔助診斷指標(biāo)。HK-2細(xì)胞上清中KIM-1的分泌一般在細(xì)胞損傷較輕、凋亡較少的情況下即出現(xiàn)顯著升高,在細(xì)胞損傷較嚴(yán)重、存活細(xì)胞數(shù)少的情況下則分泌增加較少,而細(xì)胞上清中LDH、AST、γ-GT、NAG的分泌則隨著藥物處理濃度的升高而增加,一般在細(xì)胞明顯損傷、凋亡的情況下才出現(xiàn)顯著性變化。提示:KIM-1與細(xì)胞毒性指標(biāo)及傳統(tǒng)腎損傷指標(biāo)NAG相比,可以在

12、更低的細(xì)胞損傷、凋亡作用下即出現(xiàn)顯著性變化,在腎損傷評(píng)價(jià)中可能具有更高的敏感性和特異性。
　　結(jié)論:初步建立了基于HK-2細(xì)胞評(píng)價(jià)藥物腎毒性的體外方法:首先通過(guò)比較藥物對(duì)HK-2及L-02細(xì)胞的IC10值來(lái)考察藥物毒性的器官選擇性,對(duì)藥物的腎毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià);其次通過(guò)考察藥物對(duì)HK-2細(xì)胞的存活、凋亡及毒性指標(biāo)LDH、AST、γ-GT、NAG、KIM-1的變化綜合評(píng)價(jià)藥物的體外腎毒性,為新藥研發(fā)早期腎毒性評(píng)價(jià)與篩選提供體外檢測(cè)方法