Tim-3在HSP急性期患兒Th17-Treg平衡失調(diào)中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 過敏性紫癜（HenochScholeinPurpura，HSP）是兒童時(shí)期最常見的自身免疫性小血管炎性疾病，病因及發(fā)病機(jī)制至今未明。主要發(fā)生在5-15歲兒章及青少年群體，成人及嬰幼兒相對(duì)而言少見。非血小板減少性紫癜是該病的主要特點(diǎn)。該病還可能累及關(guān)節(jié)、胃腸道、腎臟，大腦、肺臟，陰囊等。感染、疫苗接種、藥物、食物等可能是該病的誘發(fā)因素。雖然HSP被認(rèn)為是一種自限性疾病，但因累及器官較多，可造成患兒遷延不愈，特別是

2、腎臟的累及，有可能導(dǎo)致患兒終生就醫(yī)。有些患者甚至發(fā)展為腎功能衰竭，在很大程度上影響著其治愈程度以及后期的生活質(zhì)量。發(fā)病患者中有1/3還可能會(huì)復(fù)發(fā)，而腎臟的累及則是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)及遷延不愈的主要原因之一。因此，充分了解HSP的發(fā)病機(jī)制，從根本上治療該疾病，提高患兒的生活質(zhì)量，不但是臨床工作者亟待解決的問題，也是小兒免疫性疾病領(lǐng)域一直渴望攻克的難關(guān)。近年來，相關(guān)學(xué)者利用先進(jìn)的生物學(xué)技術(shù)，從分子、基因等層面去分析探討HSP的發(fā)病機(jī)制，并且結(jié)合大

3、量相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查資料，探索并尋求有效的治療途徑，雖然也取得了相應(yīng)的成果，但是對(duì)于HSP發(fā)病機(jī)制、診療措施等方面依然有很多問題有待探究，有待解決，這些問題的解決對(duì)HSP疾病的診療及預(yù)后具有重要意義。
　　 目前相關(guān)研究表明該病的發(fā)病與機(jī)體免疫功能異常有關(guān)，包括T淋巴細(xì)胞功能失調(diào)、體液免疫紊亂和細(xì)胞因子分泌異常。炎癥機(jī)制、凝血與纖溶機(jī)制和基因易感性等也可能參與其發(fā)病。小血管周圍多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管壁IgA

4、復(fù)合物、補(bǔ)體及其他免疫復(fù)合物沉積是HSP的基本病理特征。HSP患者急性期血清IgA水平升高及某些非特異性的前炎性因子，如腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-α、白介素6(interleukin-6，IL-6)等增加，暗示著炎癥、免疫紊亂及自身免疫耐受被打破在HSP發(fā)病及進(jìn)展過程中，發(fā)揮著極為重要的作用。Sugiyama等曾報(bào)道切除扁桃體并應(yīng)用強(qiáng)的松成功治療了HSP引發(fā)的紫癜性腎炎。SomeyaT等曾報(bào)道對(duì)甾類

5、激素耐藥的HSP患者應(yīng)用免疫抑制劑可以有效緩解病情。越來越多的研究結(jié)果表明免疫調(diào)節(jié)可以降低HSP局部炎癥擴(kuò)散，延緩病情發(fā)展。
　　 B細(xì)胞多克隆活化產(chǎn)生相應(yīng)抗體，加重疾病的炎癥反應(yīng)是多年來公認(rèn)的HSP典型的免疫紊亂特點(diǎn)。但是T細(xì)胞功能異常和細(xì)胞因子比例失調(diào)越來越受到了關(guān)注，相關(guān)報(bào)道表明CD4+T細(xì)胞各亞群比例失調(diào)和功能紊亂可能是HSP免疫失耐受的重要原因。
　　 輔助性T細(xì)胞17(Thelpercells17，Th17c

6、ells)是新近發(fā)現(xiàn)的不同于輔助性T細(xì)胞1(Thelpercells1，Th1cells)和輔助性T細(xì)胞2(Thelpercells1，Th2cells)的輔助性T細(xì)胞(Thelper,Th)亞群，定義為表達(dá)白介素17(interleukin-17，IL-17)的CD4+T細(xì)胞，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）和IL-6是Thl7細(xì)胞分化所必需的細(xì)胞因子，而白介素23(interleu

7、kin-23，IL-23)對(duì)Th17的擴(kuò)增及維持起到重要作用。Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病和慢性炎癥的發(fā)病、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中有非常重要的作用。目前，在各種自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、以及哮喘等患者的血清及組織中檢測(cè)到了IL-17的高表達(dá)。同時(shí)，IL-17缺陷小鼠或用IL-17受體拮抗劑處理的小鼠表現(xiàn)出對(duì)佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、或?qū)嶒?yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimentalautoimmunecere

8、brospinalmeningitis，EAE)的抵抗。以上結(jié)果提示，IL-17參與了人或動(dòng)物多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程。而Th17細(xì)胞與HSP的發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系，也成為了相關(guān)研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。許多研究表明HSP急性期患兒存在Th17細(xì)胞活化現(xiàn)象，提示Th17細(xì)胞參與了HSP的發(fā)病過程。LiYY等曾報(bào)道與健康兒童相比，HSP急性期忠兒外周血Th17細(xì)胞、Th2細(xì)胞比例顯著增高，推斷Th17細(xì)胞與HSP的發(fā)病密切相關(guān)。JenHY等最近

9、也做了相關(guān)的研究，研究結(jié)果表明HSP急性期患兒外周血Th17細(xì)胞比例升高，IL-17水平顯著升高，Th17細(xì)胞很有可能參與了HSP的炎癥反應(yīng)過程。楊軍等曾報(bào)道HSP急性期患兒Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤獨(dú)核受體(Retinoid-relatedorphannuclearreceptor-γt，ROR-γt)表達(dá)明顯增加，提示Th17細(xì)胞過度活化。白介素18(interleukin-18，IL-18)是一種新近發(fā)現(xiàn)的前炎性因

10、子，其可以促進(jìn)IL-6和白介素8(interleukin-8，IL-8)的分泌，而IL-6和IL-8與IL-17的分泌、Th17細(xì)胞的分化以及HSP的發(fā)病密切相關(guān)。
　　 機(jī)體中對(duì)相關(guān)炎癥及免疫反應(yīng)能夠起到抑制及調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞很多，如樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregulatorycells，Treg)等，而Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尤為顯著。Treg細(xì)胞對(duì)機(jī)體自身抗原的免疫耐受及抑制相應(yīng)免疫反應(yīng)過度活化方

11、面起到了十分重要的作用。叉頭翼狀旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子3(Forkhead-wingedhelixtranscriptionfactor3，F(xiàn)oxp3)基因是其特異性標(biāo)志，對(duì)Treg細(xì)胞的活化及功能調(diào)節(jié)方面起到了至關(guān)重要的作用。有報(bào)道表明缺乏Foxp3基因的小鼠模型可以發(fā)生致命的炎癥反應(yīng)，而該炎癥反應(yīng)可以通過移植Treg細(xì)胞將其控制。Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的機(jī)制很多，如它可以競(jìng)爭(zhēng)性的聚集在樹突狀細(xì)胞周圍，從而抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖及活化。炎癥及

12、免疫反應(yīng)發(fā)生時(shí)，Treg細(xì)胞可以聚集于損傷組織局部發(fā)揮相應(yīng)功能。我國(guó)學(xué)者近期發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在HSP中同樣存在數(shù)量和功能的異常。王強(qiáng)等報(bào)道HSP急性期患兒外周血Treg細(xì)胞比例降低。楊軍等也有過類似的報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn)HSP急性期患兒外周血Treg細(xì)胞比例明顯低于健康兒章。但LiYY等的報(bào)道結(jié)果與之不同，其研究結(jié)果顯示與健康兒童相比，HSP急性期患兒外周血Treg細(xì)胞比例未見明顯差異。
　　 綜上所述，雖然Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞

13、都是CD4+T細(xì)胞來源的Th亞群，但在HSP中卻可能存在二者失衡的情況。該失衡情況是否與HSP的發(fā)病相關(guān)，以及該失衡與疾病嚴(yán)重程度是否相關(guān)，該失衡是否可以作為檢測(cè)指標(biāo)反應(yīng)HSP的疾病嚴(yán)重程度，解決以上問題對(duì)于探討HSP的發(fā)病機(jī)制，尋求有效的治療途徑具有重要意義。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tcellimmunoglobulin-andmucindomain-containingmolecules，Tim-3)是新近發(fā)

14、現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的分子。該分子通過與其配體半乳糖凝集素-9(Galectin-9)結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)作用，可以下調(diào)Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞反應(yīng)，在免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在非肥胖型糖尿病，EAE等Th1型應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)的自身免疫性疾病的患者和動(dòng)物模型中已經(jīng)檢測(cè)出Tim-3，Galectin-9，T-bet轉(zhuǎn)錄因子(T-boxexpressedinTcells，T-bet)等因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)失衡。Tim-3在CD4+T細(xì)胞

15、上的表達(dá)變化也是近幾年關(guān)注的熱點(diǎn)。Jones等曾報(bào)道在人類免疫缺陷病毒感染的患者CD4+T細(xì)胞上Tim-3表達(dá)上調(diào)。YingL等也報(bào)道風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎急性期患者CD4+T細(xì)胞Tim-3表達(dá)上調(diào)。目前，通過激活Tim-3/Galectin-9通路下調(diào)Th17細(xì)胞的作用已成為自身免疫性疾病相關(guān)研究的重要著眼點(diǎn)。
　　 近年來，Tim-3/Th17/Treg關(guān)聯(lián)軸與HSP發(fā)病的聯(lián)系正日益受到關(guān)注。國(guó)內(nèi)外已有應(yīng)用細(xì)胞因子或受體拮抗蛋白進(jìn)行相

16、關(guān)治療的研究報(bào)道，但由于單一細(xì)胞因子在緩解癥狀和治療效果方面十分有限，因此針對(duì)參與疾病的發(fā)生、發(fā)展的上游因子的治療已成為當(dāng)前靶向治療的新趨勢(shì)。
　　 本研究以Th17，Treg，Tim-3等細(xì)胞因子為指標(biāo)，從細(xì)胞和分子水平探討Th17/Treg體系及Tim-3在HSP的發(fā)生和發(fā)展中的作用。本研究結(jié)果將為揭示HSP患者免疫紊亂及細(xì)胞因子紊亂形成的原因提供新的思路，同時(shí)也為HSP的治療提供新的見解及策略。
　　 第一部分Th

17、17/Treg失衡在HSP急性期患兒中的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的:明確HSP急性期患兒體內(nèi)外周血Th17/Treg的平衡情況，以及該平衡情況與患兒臨床表現(xiàn)和部分實(shí)驗(yàn)室檢查的相關(guān)性，探討Th17/Treg失衡在HSP發(fā)病過程中的作用及臨床意義。
　　 方法:選取23名HSP急性期患兒及18名健康對(duì)照作為研究對(duì)象，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞在各組研究對(duì)象外周血中的表達(dá)及比例變化。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組研

18、究對(duì)象血清中IL-17、IL-10、IL-18等的水平。分析HSP急性期患兒體內(nèi)Th17/Treg的平衡變化，并結(jié)合相關(guān)臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查，分析Th17/Treg的失衡狀況與HSP急性期患兒的發(fā)病及臨床表現(xiàn)的關(guān)系。
　　 結(jié)果:1、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒外周血Th17細(xì)胞比例升高。
　　 2、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒外周血CD3+CD8-IL-21+T細(xì)胞比例升高。
　　 3、與健康對(duì)照組

19、相比，HSP急性期患兒外周血Treg細(xì)胞比例降低。
　　 4、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒外周血Th17/Treg比例升高。
　　 5、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒血清中IL-17水平顯著增高。
　　 6、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒血清中IL-10水平明顯降低。
　　 7、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒血清中IL-18水平增高。
　　 8、對(duì)于HSP急性期患兒，外周血Th1

20、7/Treg比例與血沉水平呈正相關(guān)。
　　 9、對(duì)于HSP急性期患兒，外周血Th17/Treg比例與患兒臨床表現(xiàn)中的受損系統(tǒng)個(gè)數(shù)呈正相關(guān)。
　　 10、對(duì)于HSP急性期患兒，外周血Th17/Treg比例與患兒腎損害呈正相關(guān)。
　　 11、對(duì)于HSP急性期患兒，外周血Th17/Treg比例與抗鏈球菌溶血素O及補(bǔ)體C3水平無相關(guān)性。
　　 結(jié)論:1、HSP急性期患兒體內(nèi)存在Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量異常的

21、情況。相關(guān)炎性因子IL-17、IL-10、IL-18濃度也出現(xiàn)異常。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及IL-17、IL-10、IL-18等炎性因子可能參與了HSP的發(fā)病過程。
　　 2、Th17/Treg失衡存在于HSP急性期患兒體內(nèi)。該失衡與疾病嚴(yán)重程度、腎臟受累等密切相關(guān)。Th17/Treg比例也許可以作為衡量HSP急性期患兒發(fā)病嚴(yán)重程度及腎臟是否受累以及腎臟受累嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　 第二部分Tim-3在HSP急性期

22、患兒體內(nèi)表達(dá)的臨床意義及Tim-3通路對(duì)Th17細(xì)胞的影響
　　 分題一:HSP急性期患兒外周血CD4+T細(xì)胞Tim-3的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的:明確HSP急性期患兒體內(nèi)外周血CD4+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)，以及相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)與患兒臨床表現(xiàn)和部分實(shí)驗(yàn)室檢查的相關(guān)性，探討Tim-3在HSP發(fā)病過程中的作用及臨床意義。
　　 方法:選取18名HSP急性期患兒及15名健康對(duì)照作為研究對(duì)象，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)各組研

23、究對(duì)象外周血CD4+T細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)。分析HSP急性期患兒CD4+T細(xì)胞中Tim-3差異表達(dá)的臨床意義，并結(jié)合相關(guān)臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查，分析其差異表達(dá)與HSP急性期患兒的發(fā)病及臨床表現(xiàn)的關(guān)系。
　　 結(jié)果:1、與健康對(duì)照組相比，HSP急性期患兒外周血CD4+Tim-3+T細(xì)胞比例下降。
　　 2、對(duì)于HSP急性期患兒，外周血CD4+Tim-3+T細(xì)胞比例與血沉水平呈負(fù)相關(guān)。
　　 3、對(duì)于HSP急性期患兒

24、，外周血CD4+Tim-3+T細(xì)胞比例與皮疹持續(xù)天數(shù)、腎損害、ASO、補(bǔ)體C3水平及患兒受損系統(tǒng)的個(gè)數(shù)無相關(guān)性。
　　 結(jié)論:1、HSP急性期患兒外周血CD4+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)異常，且與某些臨床指標(biāo)相關(guān)。
　　 2、Tim-3通路有可能參與HSP發(fā)病，該指標(biāo)也許可以作為衡量HSP疾病診斷及病情活動(dòng)的參考指標(biāo)。
　　 分題二:Tim-3通路對(duì)HSP急性期患兒外周血Th17細(xì)胞的影響及其臨床意義
　　

25、目的:明確Tim-3在HSP急性期忠兒外周血Th17細(xì)胞中的表達(dá)變化。觀察Tim-3通路阻斷后HSP急性期患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-17水平的變化。
　　 方法:選取15名HSP急性期患兒及10名健康對(duì)照作為研究對(duì)象，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)各組研究對(duì)象外周血Th17+Tim-3+T細(xì)胞的表達(dá)?？筎im-3單克隆抗體處理后，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HSP急性期患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)IL-17水平的變化。分析HSP急性期患兒外周血Th1

26、7細(xì)胞Tim-3差異表達(dá)與疾病的相關(guān)性，明確Tim-3/Th17/Treg關(guān)聯(lián)軸在HSP發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 結(jié)果:1、健康對(duì)照組Th17細(xì)胞表達(dá)少量的Tim-3，HSP急性期患兒外周血Th17細(xì)胞Tim-3基本無表達(dá)，
　　 2、與同型對(duì)照相比，Tim-3通路阻斷后HSP急性期患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)的IL-17雖然升高，但P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、與同型對(duì)照相比，Tim-3通路阻斷后健康

27、對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)的IL-17升高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、Tim-3通路阻斷后，HSP急性期患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)的IL-17高于健康對(duì)照組。
　　 結(jié)論:1、HSP急性期患兒外周血Th17細(xì)胞上Tim-3表達(dá)異常，Tim-3的異常表達(dá)很可能是導(dǎo)致Th17細(xì)胞參與HSP發(fā)病機(jī)制中的主要原因之一。
　　 2、在HSP急性發(fā)病期，Tim-3通路對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用很可能缺失，欲通過