外周Th17-Treg失衡在肺腺癌及肺鱗狀上皮細(xì)胞癌中的作用及相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、肺癌無(wú)論是發(fā)病率還是死亡率,均居全球癌癥首位。按組織病理學(xué)分類,分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌,據(jù)估計(jì),非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的80％,其中肺腺癌和肺鱗狀上皮細(xì)胞癌占據(jù)了NSCLC的絕大多數(shù)。近二十年來(lái),雖然以含鉑類化療為主的綜合治療使肺癌的生存率有所延長(zhǎng),但是五年生存率仍然低于15%,并且由于化療的附加損害,肺癌患者的生活質(zhì)量和實(shí)際生存期并未顯著改善,因此,探索新的治療手段,尋找更為有效的治療模式成為研究熱點(diǎn)。肺癌的

2、抗腫瘤免疫失衡研究可能為治療提供一種極具前景的治療模式。
　　CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)是兩類不同于Th1和Th2的CD4+T淋巴細(xì)胞。Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一類特殊分支,在維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受上發(fā)揮重要作用,可以避免免疫炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大和減輕免疫機(jī)體損傷,在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在動(dòng)物和人研究中發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的缺失可以導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫性炎癥;相反,

3、Treg細(xì)胞的增多也不利于機(jī)體,在許多癌癥中,增加的Treg細(xì)胞通過(guò)與自身免疫監(jiān)控系統(tǒng)的相互作用,抑制抗腫瘤免疫活性細(xì)胞,促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展。Foxp3是Treg細(xì)胞特異的標(biāo)記物,Foxp3屬轉(zhuǎn)錄因子Forkhead家族,它可以控制Treg細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育,剔除FoxpTreg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系,二者在分化上相互聯(lián)系,在功能上相互拮抗,二者的平衡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。目前,Th17/Treg的平衡紊亂已經(jīng)成為

4、惡性腫瘤研究領(lǐng)域中新的熱點(diǎn),但是,在非小細(xì)胞肺癌中的研究尚少,是否存在比較顯著的Th17/Treg紊亂尚不清楚,與不同分期NSCLC的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。
　　目的：
　　通過(guò)分析Th17/Treg失衡與不同分期NSCLC的關(guān)系,分析相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的水平變化,探討 Th17/Treg失衡在 NSCLC發(fā)病中的分子機(jī)制,明確Th17/Treg失衡在NSCLC中的意義。
　　方法：
　　1.收集59例非小細(xì)胞

5、肺癌患者及健康對(duì)照外周血標(biāo)本
　　臨床病理確診患者30例鱗癌、29例腺癌和10名健康對(duì)照的外周血標(biāo)本,標(biāo)本分為兩份,一份用于細(xì)胞分型、mRNA、蛋白質(zhì)檢測(cè);另一份凍存以備細(xì)胞因子檢測(cè)。
　　2.多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺腺癌和肺鱗癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達(dá)率
　　分別檢測(cè)59例NSCLC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞在T細(xì)胞中的表達(dá)率。
　　3. Real time quan

6、titative PCR檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中RORγt及FoxP3mRNA水平
　　分別提取非小細(xì)胞肺癌外周血有核細(xì)胞總RNA,用RT-PCR法檢測(cè)Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Treg細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)水平。
　　4. Western-blotting檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)水平
　　分別提取分別提取非小細(xì)胞肺癌外周血單個(gè)核細(xì)胞總蛋白,采用wester

7、n-blotting方法分別檢測(cè)RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)情況。
　　5.酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌外周血清中細(xì)胞因子的水平
　　用ELISA試劑盒分別檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌外周血清細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-10和TGF-β1的水平。
　　結(jié)果：
　　1.59例非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料
　　59例非小細(xì)胞肺癌患者,其中鱗癌30例,男性18例,女性12例,年齡56-81歲,平均年齡64.7歲;腺

8、癌29例,男性18例,女性11例,年齡55-80歲,平均年齡63.0歲,所有患者均符合WHO診斷與分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期7人,Ⅱ期13人,Ⅲ期19人,Ⅳ20人。同期選擇10名健康志愿者作為對(duì)照。
　　2.非小細(xì)胞肺癌外周血中Treg細(xì)胞表達(dá)率升高
　　流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,鱗癌組外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞表達(dá)率顯著升高(5.598±0.227%vs.3.444±0.2974%, P<0.0

9、5);腺癌組也顯著升高(7.237±0.377%vs.3.444±0.2974%,P<0.05)。
　　3.非小細(xì)胞肺癌外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)率下降
　　流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,鱗癌患者外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)率(0.4313±0.0209% vs.0.6090±0.0558%, P<0.05)明顯下降,腺癌組(0.3624±0.0273%vs.0.6090±0.0558%, P<0.05)也顯著下降。

10、>　　4.非小細(xì)胞肺癌外周血中Th17/Treg比率下降,且與分期呈負(fù)相關(guān)
　　比較分析 Th17/ Treg比率表明:與健康對(duì)照組相比,腺癌(0.1865±0.0212 vs.0.1865±0.0212,P<0.05)及鱗癌(0.0547±0.0054 vs.0.1865±0.0212, P<0.05) Th17/Treg比率明顯下降,且分期越差,比例下降越明顯,Th17/Treg比例與NSCLC分期呈負(fù)相關(guān)。
　　5.非

11、小細(xì)胞肺癌外周FoxP3mRNA表達(dá)顯著升高,但RORγtmRNA表達(dá)降低
　　RT-PCR結(jié)果表明:與健康對(duì)照組相比,鱗癌 Treg細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3mRNA表達(dá)顯著升高(0.9957±0.1799 vs.0.07382±0.01382,P<0.05),腺癌FoxP3mRNA表達(dá)顯著升高(1.681±0.2401 vs.0.07382±0.01382,P<0.05),鱗癌Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)降低(2.1

12、01±0.2759 vs.4.202±0.9663,P<0.05),腺癌RORγt表達(dá)降低(1.126±0.1725 vs.4.202±0.9663,P<0.05),鱗癌組與腺癌組相比 FoxP3mRNA(0.9957±0.1799 vs.1.681±0.2401, P>0.05), RORγtmRNA(2.101±0.2759 vs.1.126±0.1725 P>0.05)無(wú)明顯差異。
　　6.非小細(xì)胞肺癌Foxp3蛋白表達(dá)顯著

13、升高,但RORγt蛋白表達(dá)下降
　　Western-blotting結(jié)果表明:肺鱗癌和腺癌患者的 Foxp3蛋白表達(dá)分別是健康對(duì)照組的3.245( P<0.05),5.119( P<0.05),腺癌組Foxp3表達(dá)水平高于鱗癌組(5.119 vs.3.245,P<0.05);鱗癌及腺癌組RORγt蛋白表達(dá)水平分別是健康對(duì)照組的0.6693( P<0.05),0.5456( P<0.05),兩者RORγt蛋白表達(dá)水平無(wú)差異(0.66

14、93 vs.0.5456,P>0.05)。
　　7.非小細(xì)胞肺癌外周血清中IL-10、TGF-β1顯著升高,IL-6、IL-17顯著降低
　　ELISA法結(jié)果表明:與健康對(duì)照比較,鱗癌外周血清Treg細(xì)胞相關(guān)因子IL-10(898±52.45 ng/mL vs.362.00±53.25 ng/mL,P<0.05)、TGF-β1(408.9±25.5 ng/mL vs.189.4±27.51 ng/mL,P<0.05)顯著升高

15、;鱗癌組 Th17細(xì)胞相關(guān)因子 IL-6(327.8±44.44 ng/mL vs.2139±787.7 ng/mL,P<0.05)、IL-17(588.3±71.67 ng/m vs.1557±375.8 ng/mL,P<0.05)顯著下降;與健康對(duì)照比較,腺癌IL-10(1458±145.8 ng/mL vs.362.00±53.25 ng/mL, P<0.05)、TGF-β1(541.5±32.9 ng/mL vs.189.4±2

16、7.51 ng/mL,P<0.05)升高,IL-6(369.5±61.5ng/mL vs.2139±787.7 ng/mL, P<0.05)、IL-17(613.6±92.06 ng/m vs.1557±375.8 ng/mL,P<0.05)顯著下降。
　　結(jié)論：
　　1.非小細(xì)胞肺癌常見病理類型腺癌和鱗癌外周Th17/Treg平衡紊亂,Treg細(xì)胞表達(dá)顯著增強(qiáng),Th17細(xì)胞表達(dá)率下降,相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3,相