冠心病心絞痛中醫(yī)證候量化辨證標(biāo)準(zhǔn)及絡(luò)氣虛滯型動脈粥樣硬化大鼠模型病理生理學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的: 本研究以生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式下社會心理應(yīng)激因素致病作用目益受到重視為背景，以中醫(yī)絡(luò)病理論為指導(dǎo)，通過臨床流行病學(xué)調(diào)查建立定性與定量相結(jié)合的冠心病心絞痛證候辨證標(biāo)準(zhǔn)，基于證候組合與分布規(guī)律探討絡(luò)氣變化在冠心病心絞痛病機演變中的作用；依據(jù)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)建立絡(luò)氣虛滯證候模型及絡(luò)氣虛滯型動脈粥樣硬化(As)大鼠模型，并綜合評價，探討其代謝物譜特征；研究模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化規(guī)律及其與As病變的關(guān)系；離

2、體觀察與絡(luò)氣虛滯證候因素相關(guān)的血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)促大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖的信號通路機制及通絡(luò)藥物干預(yù)作用?；谏鲜雠R床與基礎(chǔ)研究探討絡(luò)氣虛滯證候因素對As病變的影響，為研究社會心理因素作用提供實驗依據(jù)，并初步揭示絡(luò)氣虛滯證候的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，同時佐證絡(luò)病理論科學(xué)價值。 方法: 本文包括四部分研究: 1. 冠心病心絞痛中醫(yī)證候量化辨證標(biāo)準(zhǔn)研究 1.1 冠心病心絞痛臨床流行病學(xué)調(diào)查

3、 以文獻研究和專家咨詢?yōu)榛A(chǔ)，確定調(diào)查與冠心病心絞痛相關(guān)的中醫(yī)證候信息并予以綜合分級量化，制定臨床調(diào)查表，選擇北京、上海、廣州、濟南、沈陽、長春等地8個調(diào)查中心，開展多中心大樣本冠心病心絞痛患者中醫(yī)證候臨床流行病學(xué)現(xiàn)況調(diào)查。調(diào)奄過程中嚴(yán)格質(zhì)量控制，保證調(diào)查數(shù)據(jù)真實可靠。 1.2 冠心病心絞痛量化辨證標(biāo)準(zhǔn)的建立 對收集的符合入選與排除標(biāo)準(zhǔn)的403例冠心病心絞痛患者，按3:1分為運算組(302名)和考核組(101名)。采用

4、基于熵的復(fù)雜系統(tǒng)分劃方法(entropy-based complex systems partition method，ECSPM)提取運算組302例患者癥狀信息，計算癥狀貢獻度，運用診斷性試驗受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)分析建立證候辨證閾值，形成量化辨證標(biāo)準(zhǔn)。以考核組101例患者進行辨證標(biāo)準(zhǔn)的前瞻性檢驗。 1.3 冠心病心絞痛中醫(yī)證候組合與分布規(guī)律研

5、究 以ECSPM進行冠心病心絞痛證候關(guān)聯(lián)度分析，計算各證候在全部冠心病心絞痛患者中所占比例，根據(jù)關(guān)聯(lián)度分析及證候分布情況探討其病機特點。 2. 絡(luò)氣虛滯型As大鼠模型的建立及其評價 以建立的絡(luò)氣虛滯證辨證標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，根據(jù)中醫(yī)“勞則氣耗”理論，以“基礎(chǔ)飲食+負(fù)重游泳”建立絡(luò)氣虛滯證候模型，以維生素D3灌胃、高蛋氨酸和高脂飼料喂養(yǎng)建立As模型，以兩種造模因素疊加建立絡(luò)氣虛滯型大鼠As模型(復(fù)合模型)。Wistar大鼠

6、隨機分為7組：①正常對照組。②As模型組。③絡(luò)氣虛滯組(負(fù)重游泳組)。④絡(luò)氣虛滯型As模型組(復(fù)合模型組)。⑤通心絡(luò)大劑量組。⑥通心絡(luò)小劑量組。⑦辛伐他汀組。以一般狀況觀察及表征半定量評分、力竭游泳時間、懸桿及曠場實驗、電生理檢測客觀評價絡(luò)氣虛滯主要證候信息(乏力、氣短、神疲、心悸癥狀)在模型大鼠的表現(xiàn)；以主動脈光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化技術(shù)α-肌動蛋白(α-actin)標(biāo)記染色、血中總膽固醇(total cholesterol，T

7、C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)檢測評價As病變程度；以代謝組學(xué)技術(shù)分析大鼠血漿代謝物譜變化。 3. 絡(luò)氣虛滯型As大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化及通心絡(luò)干預(yù)研究 以建立的絡(luò)氣虛滯模型、As模型及復(fù)合模型大鼠為研究對象，探討絡(luò)氣虛滯狀態(tài)下NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化規(guī)律及其對As病變的影響。動物分組及干預(yù)同上，實驗結(jié)束后麻醉大鼠經(jīng)頸動脈插

8、管采集血液標(biāo)本，分離血漿或血清，檢測下丘腦-垂體-腎上腺軸指標(biāo)(hvoothalamo-pituitary-adrenal axis，HPAA)：下丘腦組織促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrop(h)ic hormone，ACTH)和血清皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)(放射免疫分析法)，交感腎上腺髓質(zhì)：

9、血清去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)(ELISA法)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone svstem，RAAS)：血漿腎素活性(plasma renin activity、 PRA)、醛固酮(aldosterone，ALD)、血漿及組織Ang Ⅱ(放射免疫分析法)，細(xì)胞因子：血清白介素(interleukin，IL)-6(放

10、射免疫分析法)、干擾素(interferon，IFN)-γ(ELISA法)；留取大鼠胸主動脈常規(guī)制作石蠟組織切片，免疫組化技術(shù)檢測主動脈增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白表達(dá)。 4. Ang Ⅱ?qū)Υ笫骎SMCs增殖影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及通心絡(luò)干預(yù)作用研究 選擇絡(luò)氣虛滯證候因素干預(yù)引起NEI網(wǎng)絡(luò)紊亂的主要效應(yīng)因子AngⅡ，探討其對體外培養(yǎng)大鼠VSMCs增殖影響

11、的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及通心絡(luò)干預(yù)作用，為證候因素干預(yù)血管病變的作用機制提供實驗依據(jù)。采用組織貼塊法培養(yǎng)原代大鼠VSMCs，通過MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，激光共聚焦顯微鏡觀察STAT3核轉(zhuǎn)位，Westemblot檢測Janus激酶(Janus Kinase，JAK)2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signaltransducer and activator of transcription，STAT)3蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)

12、，以JAK2特異性抑制劑AG490和辛伐他汀做對照，探討AngⅡ?qū)SMCs增殖影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及通心絡(luò)干預(yù)作用。 結(jié)論： 1. 本研究以絡(luò)病理論為指導(dǎo)，以文獻研究、專家咨詢?yōu)榛A(chǔ)，通過多中心、大樣本臨床流行病學(xué)調(diào)查建立冠心病心絞痛證候辨證標(biāo)準(zhǔn)，運用基于熵的復(fù)雜系統(tǒng)分劃方法從原始癥狀無監(jiān)督分析入手，建立量化證候辨證標(biāo)準(zhǔn)，避免單純依靠文獻研究或?qū)＜医?jīng)驗所致主觀偏倚；由于構(gòu)成證候的癥狀之間存在著非線性復(fù)雜關(guān)系，該方法較之既

13、往研究中采用的處理線性關(guān)系方法更為準(zhǔn)確的反映了癥狀間相互作用的復(fù)雜關(guān)系，為建立證候模型并探討其病理生理學(xué)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。 2. 基于證候組合與分布規(guī)律探討冠心病心絞痛病機特點，研究結(jié)果顯示絡(luò)氣郁滯或絡(luò)氣虛滯與血瘀、痰濁(熱)、郁熱、陰虛、陽虛等證候形成較強的關(guān)聯(lián)關(guān)系，而絡(luò)氣郁滯或絡(luò)氣虛滯存在于所有冠心病心絞痛患者，所占比例高于血瘀、痰濁(熱)、郁熱、陰虛、陽虛等證候所占比例，顯示絡(luò)氣變化所致郁滯或虛滯為冠心病心絞痛的始發(fā)病因并貫穿

14、病變?nèi)^程，而國內(nèi)醫(yī)學(xué)界幾十年來所重視和研究的血瘀、痰濁(熱)等因素為冠心病心絞痛的繼發(fā)致病因素。從絡(luò)氣切入研究冠心病心絞痛不同于已有從血瘀、痰濁切入開展的研究，顯示了氣血相關(guān)的絡(luò)病理論特色，對生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式下探討各種社會心理因素的致病作用具有重要指導(dǎo)意義。 3. 以建立的絡(luò)氣虛滯證候辨證標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，以“基礎(chǔ)飲食+負(fù)重游泳”建立絡(luò)氣虛滯大鼠模型，從大鼠一般狀況觀察、生物學(xué)表征半定量評分、力竭游泳時間、懸桿實驗、行為學(xué)觀

15、察、電生理檢測客觀評價模型大鼠絡(luò)氣虛滯證主要癥狀乏力、神疲、氣短、心悸與標(biāo)準(zhǔn)一致性，也是本研究的特色之一。以As大鼠模型疊加“基礎(chǔ)飲食+負(fù)重游泳”建立病證復(fù)合動物模型，模型大鼠既具有早期纖維增生性As的局部病理特點，又表現(xiàn)出絡(luò)氣虛滯宏觀證候，代謝組學(xué)方法分析顯示3種模型代謝物譜存在明顯差異，這為探討其病理生理學(xué)基礎(chǔ)及絡(luò)氣虛滯證候因素對As病變的影響奠定了基礎(chǔ)。 4. 探討絡(luò)氣虛滯型As大鼠模NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化規(guī)律，絡(luò)氣虛滯證

16、候狀態(tài)下下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)功能紊亂、交感腎上腺髓質(zhì)與腎素-血管緊張素-醛固酮激活，而As模型沒有顯著變化。絡(luò)氣虛滯證候因素使復(fù)合模型NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)因子變化紊亂且不同程度加重的同時，又促使As病理造模因素引起的組織AngⅡ升高，總體效應(yīng)表現(xiàn)為復(fù)合模型反映平滑肌細(xì)胞增殖的PCNA表達(dá)明顯高于As模型，揭示了絡(luò)氣虛滯證候因素可通過引起NEI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)相關(guān)因子調(diào)控失常影響As病變。 5. 以絡(luò)氣虛滯證候因素作用相關(guān)的AngⅡ為干預(yù)因

17、子，探討其對體外培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。結(jié)果表明AngⅡ可明顯促進大鼠平滑肌細(xì)胞增殖，與其促進細(xì)胞由G0/G1期進入S期有關(guān)。同時AngⅡ可促進平滑肌細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3表達(dá)，促進STAT3核轉(zhuǎn)位，而上述作用可被JAK2的特異性阻斷劑AG490阻斷，顯示其促平滑肌細(xì)胞增殖作用與JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。 6. 復(fù)方通心絡(luò)和辛伐他汀對疊加證候造模因素和病理造模因素的復(fù)合模型的