骨髓初始髓源抑制細(xì)胞亞群表型鑒定及對T細(xì)胞免疫抑制功能的研究.pdf

1、目的: MDSCs是一群異質(zhì)性的細(xì)胞,通常在腫瘤,感染,炎癥和移植等病理情況時增多。一般認(rèn)為,在病理狀態(tài)下,MDSCs對免疫系統(tǒng)具有廣泛的抑制作用,發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能;而正常狀態(tài)下,MDSCs是否具有免疫抑制作用尚有爭論。目前,多數(shù)研究是針對腫瘤和感染等病理條件下混合 MDSCs或 MDSCs的亞群進(jìn)行研究,而對骨髓初始MDSCs的研究相對較少。本實驗旨在使用Gfi1:GFP基因敲入小鼠模型,從正常模型小鼠的骨髓中分離初始MDSCs

2、(na?ve MDSCs),運用流式細(xì)胞儀(BD FACS Aria)分選不同亞群細(xì)胞,采用免疫學(xué)方法,研究初始MDSCs及其亞群在正常情況下可能具有的表型和T細(xì)胞免疫抑制功能;重點研究骨髓na?ve MDSCs不同亞群對T細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制。
　　方法:通過對Gfi1:GFP基因敲入C57BL/6J小鼠模型骨髓細(xì)胞分離純化,利用免疫磁珠技術(shù)分離骨髓初始MDSCs(CD11b+細(xì)胞),流式細(xì)胞儀檢測分選純度;利用離心涂片法和W

3、right Giemsa染色法對初始 MDSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析;將骨髓初始MDSCs分別與CD3/28 Dynabeads T-Activator預(yù)刺激的CD4+T或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測它們對CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖功能的影響。利用流式細(xì)胞技術(shù)根據(jù)CD11b、Gr1和Gfi1:GFP表達(dá)的差異將MDSCs分為不同亞群,并鑒定其表型 CD62L、Ly6C、CD204、CD206、CD80、CD86、TLR4、TLR2

4、、CD124、CD210等的表達(dá)差異;用離心涂片法和Wright Giemsa染色法對不同亞群進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析;用純化的骨髓初始 MDSCs的不同亞群細(xì)胞分別與 CD3/28 Dynabeads T-Activator預(yù)刺激的CD4+T或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測它們對CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖功能的影響;并應(yīng)用Realtime-PCR方法檢測不同亞群細(xì)胞抗炎因子及相關(guān)酶 mRNA的表達(dá),從而初步探討它們發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分

5、子機(jī)制;進(jìn)而使用相關(guān)酶的抑制劑阻斷并且應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步的觀察哪一種酶起主要作用。
　　結(jié)果:骨髓初始 MDSCs是健康小鼠免疫細(xì)胞的重要組成成分,其形態(tài)為大小不一、胞質(zhì)呈淡藍(lán)色、核為分葉形、環(huán)形或橢圓形的細(xì)胞群;初始MDSCs在體外可以抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖,在體內(nèi)可以延緩和降低小鼠急性肝衰竭模型的死亡率。按CD11b、Gr1和Gfi1:GFP等分子表達(dá)的差異及細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異可將初始MDSCs分為四個亞群:CD

6、11b+Gr1+ GFP-(M1)、CD11blowGr1low GFP+(G1)、CD11blowGr1high GFP+(G2)及CD11bhighGr1high GFP+(G3)。在正常小鼠骨髓細(xì)胞中,G1群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的1.19±0.38％,占骨髓初始MDSCs的4.04±0.9%;G2群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的8.49±2.69%,占骨髓MDSCs的28.9±5.25%;G3群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的6.04±1.55%,占骨髓MDS

7、Cs的20.95±4.98%;M1群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的3.86±1.06%,占骨髓MDSCs的13.25±2.65%。G1群細(xì)胞體積較大主要是以環(huán)形核幼稚的粒細(xì)胞為主,G2群細(xì)胞以環(huán)形核和分葉核的幼稚粒細(xì)胞為主,G3群細(xì)胞是以分葉核和多形核幼稚粒細(xì)胞為主,而M1亞群細(xì)胞體積較小,胞質(zhì)灰藍(lán)色,多為圓形和橢圓形核,主要是幼稚單核細(xì)胞。G1和G2亞群細(xì)胞均高表達(dá) CD62L和Ly6C,M1和G3亞群細(xì)胞高表達(dá)Ly6C且部分高表達(dá)CD62L,四

8、個亞群細(xì)胞均低表達(dá)CD204、CD206、TLR2及共刺激分子CD80、CD86和CD124(IL-4受體),不表達(dá)TLR4和CD210(IL-10受體)。G2和G3兩群細(xì)胞分別可以不同程度的抑制CD4+T(P<0.05;P<0.01)和CD8+T(P<0.01;P<0.01)細(xì)胞增殖,而G1和M1亞群細(xì)胞對CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。G2和G3兩群細(xì)胞可能通過上調(diào)IL-4、IL-10和IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮免

9、疫抑制作用(P<0.01;P<0.01),該免疫抑制作用可能與ArgⅠ和NOS2兩種酶的活性無關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.正常小鼠骨髓初始MDSCs(CD11b+細(xì)胞)能分別抑制CD4+T或CD8+T細(xì)胞增殖,并且能延緩和降低小鼠急性肝衰竭模型的死亡率。
　　2.根據(jù)初始MDSCs的CD11b、Gr1和Gfi1:GFP表達(dá)差異及細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異可將其可分為M1、G1、G2及G3四個亞群:單核系亞群細(xì)胞M1(CD11b+Gr

10、1+GFP-)和粒系亞群細(xì)胞G1(CD11blowGr1low GFP+)、G2(CD11blowGr1high GFP+)及G3(CD11bhighGr1high GFP+)。
　　3.在骨髓初始MDSCs四個亞群中,G2和G3均能不同程度的抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖,而G1和M1對CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用;G2亞群細(xì)胞可能通過分泌抗炎因子IL-4、IL-10發(fā)揮免疫抑制作用,G3亞群細(xì)胞可能通過分