首烏方對(duì)帕金森病大鼠血液左旋多巴藥代動(dòng)力學(xué)與腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響.pdf

1、研究目的及依據(jù)
　　 藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和藥效動(dòng)力學(xué)(PD)是藥理學(xué)研究的兩個(gè)重要概念,PK描述不同體液中藥物濃度隨時(shí)間變化的過程,PD描述藥效隨效應(yīng)部位藥物濃度變化的過程。雖然PK和PD是在同一個(gè)生物個(gè)體、隨時(shí)間同步發(fā)生的兩個(gè)動(dòng)力學(xué)過程,值常規(guī)的藥理學(xué)研究方法,難以將兩者有機(jī)結(jié)合并同時(shí)研究,因此,難以正確地反映藥物濃度.靶部位效應(yīng).時(shí)間的三維關(guān)系。應(yīng)用微透析技術(shù)對(duì)清醒或麻醉動(dòng)物的血液及其他靶部位進(jìn)行連續(xù)、同步采樣的方法,為PK

2、-PD的結(jié)合研究提供了可能的手段[1]。
　　 帕金森病是一種黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)功能受損所致DA與乙酰膽堿平衡失調(diào)的一種慢性疾病,以運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫和強(qiáng)直為主要特征。其治療一般采用以左旋多巴(levodopa,L-DOPA)為主的替代療法,可以減輕患者癥狀,延緩病程進(jìn)展。但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng),L-DOPA療效逐漸減弱,副作用逐漸增強(qiáng),成為臨床治療棘手的問題。中醫(yī)藥辨證論治和中西醫(yī)結(jié)合治療帕金森病

3、的實(shí)踐證明,中藥有一定的改善臨床癥狀的療效,或可以增加西藥治療作用、減輕其副作用,提高患者生存質(zhì)量,首烏方就是經(jīng)臨床驗(yàn)證有效的中藥復(fù)方專一[2]
　　 本實(shí)驗(yàn)通過建立血、腦雙位點(diǎn)微透析采樣方法,結(jié)合高效液相色譜一熒光檢測(cè)技術(shù)(HPLC-FLD),同體、同步監(jiān)測(cè)清醒、自由活動(dòng)大鼠血液中L—DOPA濃度與腦內(nèi)紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化,探討L-DOPA血藥濃度-靶器官效應(yīng)-時(shí)間的關(guān)系,進(jìn)而探討首烏方協(xié)同L-DOPA治療

4、帕金森病的作用機(jī)理。
　　 研究方法
　　 1 HPLC-FLD法測(cè)定清醒自由活動(dòng)大鼠紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平應(yīng)用氨基酸分析柱(Eclipse AAA4.6×150 mm,5μm)和鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化方法。流動(dòng)相:A液為緩沖液:甲醇:四氫呋喃(V:V:V)=400:95:5；B液為緩沖液:甲醇(V:V)=120:380,二元梯度洗脫。緩沖液為20 mM乙酸鈉溶液(PH7.2):流速:0.8 mL·m

5、in-1；增益:12；分離后的氨基酸衍生化合物用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng):340 nm,發(fā)射波長(zhǎng):455 nm。
　　 2 HPLc-FLD法測(cè)定清醒自由活動(dòng)大鼠血液中游離L-DOPA水平色譜柱為MERCK Lichrospher100 C18(5μm,250 mm×4 mm),預(yù)柱Nova-Pak C18；柱溫:35℃；激發(fā)波長(zhǎng)278 nm,發(fā)射波長(zhǎng)325 nm；流動(dòng)相為水:甲醇(90:10),其中水相含EDTA.0.08

6、 mmol·L-1,KH2PO470 mmol·L-1,庚烷磺酸鈉2.08mmol·L-1。流速1.0 ml·min-1。
　　 3大鼠紋狀體定向注射6-OHDA造成帕金森病大鼠模型微透析采樣的前7天,大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,立體定位儀定位于大鼠右側(cè)紋狀體(A:+0.2 mm,R:+3 mm,V:7.5 mm),埋入探針套管,并將0.2％的6-OHDA生理鹽水溶液以32μg·kg-1、1μl·min

7、-1的速度注入,造成腦內(nèi)單點(diǎn)注射6-OHDA所致的帕金森病大鼠模型。對(duì)照組注射相應(yīng)體積的生理鹽水。
　　 4血、腦雙位點(diǎn)微透析準(zhǔn)備及操作過程大鼠腦部微透析探針套管埋置手術(shù)參見6-OHDA造模。血液探針置入手術(shù)于微透析前一天進(jìn)行:麻醉下,經(jīng)大鼠左側(cè)頸靜脈插入并固定,用1％的肝素鈉生理鹽水溶液灌流30 min,流速2.0μl·min-1,之后改用復(fù)方氯化鈉灌流。大鼠腹腔埋植導(dǎo)管,從背部引出并固定,用于微透析過程中大鼠腹腔給藥。次日,

8、于大鼠清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下插入腦部探針。血液探針和腦部探針用復(fù)方氯化鈉以2.5μl·min-1的速度灌流平衡60 min之后,腦探針的灌流液改為5 mmol·L-1的水楊酸鈉林格氏液,平衡60 min后,開始采樣:收集透析液,每15 min收集管。采樣60 min后,經(jīng)腹腔導(dǎo)管投與美多芭,高劑量組60mg·kg-1、低劑量30 mg·kg-1；模型組、對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。動(dòng)態(tài)觀察血、腦微透析液中相關(guān)指標(biāo)共420 min。實(shí)驗(yàn)過程

9、見圖1。
　　 研究結(jié)果
　　 1 HPLC-FLD檢測(cè)清醒自由活動(dòng)大鼠紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的方法同日內(nèi)測(cè)定Glu、GABA標(biāo)準(zhǔn),相對(duì)變異系數(shù)(RSD)值依次為:Glu:0.52％；GABA:1.57％(n=5)。用250.0～2.0μg·L-1的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定,線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)依次為:Glu:0.9996；GABA:0.9990。清醒大鼠紋狀體微透析液中五種氨基酸均有較好的峰高和峰面積響

10、應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)和透析液的色譜圖幾乎無(wú)雜峰干擾。
　　 2 HPLC-FLD檢測(cè)清醒大鼠血液中L-DOPA水平的方法同日內(nèi)測(cè)定三個(gè)濃度:5、125、0.3125 mg·L-1的L-DOPA標(biāo)準(zhǔn),RSD值依次為:1％,0.6％,3.8％(n=5)。用5.0～0.078125mg·L-1的各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測(cè)定,線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)為:0.99962,最低檢測(cè)限為0.38 ng。
　　 3血液中L-DOPA的藥代動(dòng)力學(xué)

11、研究大鼠腹腔給藥后,藥物迅速吸收入血,各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的L-DOPA血藥濃度.時(shí)間曲線符合一室模型。美多芭高、低劑量模型組和高劑量對(duì)照組的AUC分別為1761.33±225.73,668.31±91.85和2407.67±160.72 mg·L-1min-1；t1/2z分別為56.62±9.18,66.05±10.77和160.68±17.67min；Cmax分別為18.31±2.53,9.67±1.06和24.69±2.31 mg·L-

12、1；Tmax分別為45,33±6.71和45 min。
　　 4帕金森病模型大鼠紋狀體細(xì)胞外液Glu、GABA水平的動(dòng)態(tài)變化及美多芭對(duì)其的影響造模后一周,與對(duì)照組相比,模型組Glu水平明顯升高,其中有10個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。GABA水平顯著降低,其中有4個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(_P<0.05或P<0.01)。與模型組相比,美多芭低劑量模型組和美多芭高劑量模型組的Glu水平均顯著降低,分別有13個(gè)時(shí)間

13、點(diǎn)和12個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P<0.05或P<0.01),而GABA水平則升高,分別有7個(gè)和14個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
　　 5大鼠血液中L-DOPA藥動(dòng)學(xué)與靶器官藥效學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性L-DOPA藥動(dòng)學(xué)指標(biāo)選擇大鼠血液中L-DOPA藥物濃度,靶器官的藥效學(xué)指標(biāo)選擇大鼠紋狀體細(xì)胞外液的Glu水平(以基礎(chǔ)值的百分率表示)。對(duì)各相同時(shí)間點(diǎn)藥動(dòng).藥效指標(biāo)的同步變化進(jìn)行相關(guān)性動(dòng)態(tài)分析(回歸性分析),美多芭低劑

14、量組和美多芭高劑量組的R2值分別為0.7332和0.8055；以血液中L-DOPA的濃度變化與大鼠紋狀體細(xì)胞外液Glu與GABA的比值進(jìn)行上述相關(guān)性動(dòng)態(tài)分析,美多芭高劑量組兩者的相關(guān)系數(shù)R2值為0.7950。
　　 6首烏方(SWF)對(duì)大鼠血液中L-DOPA藥代動(dòng)力學(xué)的影響與美多芭低劑量模型組比較,SWF+美多芭低劑量模型組有8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的L-DOPA濃度顯著升高(P<0.01或P<0.05)。
　　 7首烏方(SWF)對(duì)

15、大鼠紋狀體細(xì)胞外液GIu/GABA水平的影響與模型組相比,美多芭低劑量模型組大鼠腦內(nèi)紋狀體細(xì)胞外液的Glu/GABA有9個(gè)時(shí)點(diǎn)顯著降低,SWF+美多芭低劑量模型組有8個(gè)時(shí)點(diǎn)有顯著降低(P<0.05或P<0.01)；SWF+美多芭低劑量模型組與美多芭低劑量模型組相比,各時(shí)點(diǎn)的Glu/GABA沒有顯著性差異,但該組的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)更加接近正常對(duì)照組。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠血、腦雙位點(diǎn)微透析采樣、高效液相色譜.熒光