胰島素對不穩(wěn)定斑塊形成的影響及機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　急性冠狀動脈綜合征(Acutecoronarysyndrome,ACS)是冠心病中致死率最高的臨床類型。眾多研究表明,決定ACS發(fā)生的關(guān)鍵因素是冠狀動脈內(nèi)斑塊的穩(wěn)定性,所以不穩(wěn)定斑塊(unstableplaque)是ACS的關(guān)鍵病理基礎(chǔ),不穩(wěn)定斑塊發(fā)生糜爛或破裂,誘發(fā)急性血栓形成,最終導(dǎo)致惡性心血管事件發(fā)生。深入研究不穩(wěn)定斑塊的形成以及破裂對臨床防治ACS,減少死亡率至關(guān)重要。但斑塊―不穩(wěn)定性‖機制尚不清楚。

2、>　　近年研究表明,炎癥反應(yīng)可以改變動物粥樣硬化斑塊的結(jié)構(gòu),參與動脈粥樣硬化斑塊的破裂,針對介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號通路進(jìn)行有效干預(yù)是阻止不穩(wěn)定斑塊形成的重要環(huán)節(jié)。而Toll樣受體4(TLR4)信號介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是與粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)的重要分子機制,如何調(diào)控TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是穩(wěn)定斑塊、減少ACS發(fā)生的關(guān)鍵。胰島素一直被認(rèn)為是調(diào)節(jié)糖代謝的重要激素,但近年來,越來越多的證據(jù)表明:胰島素具有多重作用,除了調(diào)節(jié)血糖代謝外,還可以通過

3、PI3K-AKT通路抑制炎癥反應(yīng)。聯(lián)系以往研究,在機體TLR-NF-κB信號通路被激活,炎癥反應(yīng)不斷發(fā)展的過程中,PI3K-AKT通路活性受到抑制,但是加強PI3K-AKT通路活性受是否可以影響TLR-NF-κB信號通路則尚未見報道?；谝陨衔覀冊O(shè)計并完成了相關(guān)實驗。
　　研究目的:
　　1.建立ApoE基因缺陷小鼠(ApoE-/-mice)不穩(wěn)定斑塊模型,觀察胰島素對斑塊形成的影響;
　　2.建立泡沫細(xì)胞模型模擬動脈

4、粥樣硬化斑塊形成,觀察胰島素對泡沫細(xì)胞形成的影響;
　　3.探討胰島素對泡沫細(xì)胞形成影響的機制,特別是對TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。
　　實驗方法:
　　1.40只6-8WApoE‐/‐小鼠高脂喂養(yǎng)1W后,隨機分為對照組和手術(shù)組。手術(shù)組小鼠行右側(cè)頸總動脈套管術(shù),術(shù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8W。8W末隨機取手術(shù)組小鼠,過量麻醉處死,HE觀察小鼠頸動脈斑塊形成情況。
　　2.確認(rèn)斑塊形成后,將手術(shù)組小鼠隨機分為兩組:手術(shù)組和

5、胰島素組。胰島素組給予胰島素皮下注射2W,手術(shù)組則用生理鹽水代替。2W后,過量麻醉劑處死小鼠,ELISA法測小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌,HE染色觀察頸動脈斑塊形態(tài),油紅O染色觀察斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集,巨噬細(xì)胞免疫組化觀察斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集。
　　3.體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7,建立巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞模型。隨機分為5組:(1)對照組;(2)ox-LDL組;(3)ox-LDL+insulin組;(4)ox-LDL+ins

6、ulin+wortmannin組;(5)ox-LDL+wortmannin組。油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況,ELISA法測培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α和IL-6分泌,TUNEL法測巨噬細(xì)胞凋亡,real-timePCR法測TLR4、MMP9的mRNA轉(zhuǎn)錄情況,westernblot法測TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表達(dá)。
　　實驗結(jié)果:
　　1.ApoE‐/‐小鼠通過PCCP手術(shù)高脂喂養(yǎng)8W后,HE染色結(jié)果顯示:手術(shù)

7、組小鼠頸動脈內(nèi)出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊,其內(nèi)部脂質(zhì)池較大,而對照組小鼠頸動脈管壁光滑,無斑塊形成,建模成功。
　　2.胰島素注射2W后,三組小鼠的TC、TG、以及LDL無顯著差異。ELISA測外周血炎性因子TNF-α與IL-6顯示:手術(shù)組與對照組炎性因子無差異;與手術(shù)組比較,胰島素組血清炎性因子含量減少,有顯著差異(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示:與手術(shù)組相比,胰島素組頸動脈腔內(nèi)的斑塊脂質(zhì)池減少,斑塊結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定;油紅O染色結(jié)果顯示

8、:與手術(shù)組相比,胰島素組斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著降低(P<0.05);巨噬細(xì)胞免疫組化染色顯示:胰島素組較手術(shù)組巨噬細(xì)胞含量顯著降低(P<0.05)。
　　3.油紅O染色與TUNEL結(jié)果顯示:50mg/L的ox-LDL可以成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化,巨噬細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴顆粒存在,且促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡(P<0.01vs對照組),而胰島素干預(yù)后可以顯著抑制巨噬細(xì)胞對ox-LDL的吞噬,細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顆粒顯著減少,巨噬細(xì)胞凋亡減少(P<0.01

9、vsox-LDL),而應(yīng)用PI3K抑制劑抑制胰島素PI3K信號通路后胰島素的作用被顯著減弱(P<0.01vsox-LDL+insulin)。
　　4.ox-LDL干預(yù)細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α與IL-6分泌顯著增加(P<0.01);TLR4、Myd88、NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05vs對照組),同時與對照組相比,MMP9的mRNA水平也顯著增高(P<0.01)。胰島素干預(yù)后,培養(yǎng)液中的炎性因子T

10、NF-α與IL-6分泌顯著下降(P<0.01vsox-LDL),TLR4、Myd88、NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05vsox-LDL),同時MMP9的mRNA水平也顯著降低(P<0.01vsox-LDL)。PI3K抑制劑抑制胰島素PI3K信號通路后,胰島素的抑制作用被顯著減弱,TNF-α與IL-6分泌顯著增加(P<0.01vsox-LDL+insulin),TLR4、Myd88、NF-κB、MMP9的mRNA和

11、蛋白水平也顯著增加(P<0.05vsox-LDL+insulin)。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了ApoE-/-小鼠不穩(wěn)定性較高的動脈粥樣斑塊模型,胰島素干預(yù)可以有效降低小鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6的含量,降低小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性;
　　2.胰島素可以抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化,抑制由于ox-LDL誘導(dǎo)引起的炎性因子TNF-α、IL-6的分泌與巨噬細(xì)胞凋亡;
　　3.胰島素通過PI3K-AKT信