血清肌紅蛋白和心肌肌鈣蛋白Ⅰ光激化學發(fā)光免疫測定法的建立.pdf

1、研究背景：急性心肌梗死(AMI)是嚴重危及人類生命的主要疾病之一，早期診斷有利于早期治療進而減少患者的死亡率。診斷AMI的主要依據(jù)是特征性病史、心電圖特異性變化和血清生化標志物的檢測。大量臨床實踐發(fā)現(xiàn)，大約25％的AMI患者在發(fā)病早期沒有典型的臨床表現(xiàn)，只有大約50％的AMI患者出現(xiàn)特征性的心電圖改變，這使得血清生化標志物的檢測在AMI的診斷中具有重要作用。隨著檢測技術(shù)的改進和發(fā)展，心肌損傷血液生化標志物的檢測已從酶活性檢測發(fā)展到以蛋白

2、質(zhì)量為主的免疫檢測。肌紅蛋白(Mb)是目前公認的最合適有效的心肌損傷早期標志物，心肌細胞損傷后，血中Mb濃度的升高早于其他標志物，Mb陰性特別有助于排除AMI的診斷，如果在胸痛發(fā)作后4h№濃度沒有升高，就可以基本排除AMI，Mb的這一特性十分有助于急性胸痛患者的快速分辯。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)對心肌損傷具有高度的敏感性和特異性，是目前最好的心肌損傷確定標志物。血清cTnI濃度于心肌損傷后4-12h升高并可持續(xù)7—10天。國內(nèi)外有關(guān)學

3、術(shù)團體都建議使用一個早期標志物和一個確定標志物進行聯(lián)合檢測用于AMI的診斷。因此，快速、可靠的Mb和cTnI免疫測定法的建立對AMI的診斷、治療、預后判斷等具有重要意義。 本研究分三個部分，第一部分：目的:采用光激化學發(fā)光免疫測定法(MCI)建立快速簡便的血清Mb檢測方法。方法:使用針對№不同表位的兩株單克隆抗體，一株包被發(fā)光微粒，另一株進行生物素化，與包被有鏈霉親合素的感光微粒共同構(gòu)成檢測試劑，優(yōu)化檢測條件并評價檢測性能。結(jié)果

4、:方法的分析靈敏度為L36ng／m1，在33．8-152lng／ml的范圍內(nèi)線性良好。批內(nèi)和日間變異系數(shù)分別為3．28％一4．41％和5．80％～6．56％。在溶血(Hb<2．6g／L)、黃疸(BIL<20mg／d1)和脂血(TG<1000mg／d1)時對方法的干擾無臨床意義。與RocheElecsys電化學發(fā)光法具有很好的相關(guān)性(r=O．9971)，兩種方法檢測結(jié)果的差異無顯著性(P=-O．678)。方法在Mb濃度為3000ng／ml

5、時無HOOK效應。男性組的平均Mb濃度顯著高于女性組(39．21ng／mlvs28．ng/ml，P＜O．OD，男性和女性的參考范圍(2．5—97．5百分位值)分別為9．64—86．18ng／m1和6．49—65．85ng／m1。MbLICI的主要試劑在4℃條件下5周內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。第二部分：目的:從人心肌組織提取純化心肌肌鈣蛋白I。方法:首先采用離子交換層析和疏水層析從兔骨骼肌中提純肌鈣蛋白C(TnC)，然后制備連接有Tnt的親和層

6、析介質(zhì)，通過親和層析法從人心肌組織中直接提純cTnI。純化的cTnI采用SDS-PAGE和WesternBlotting進行鑒定。結(jié)果:從10g人心肌組織中共提純2．44mgcTnI，SDS—PAGE電泳圖上顯示為單一條帶，表觀分子量約為29KDa。WesternBlotting結(jié)果表明單克隆抗體能夠特異性識別提純的cTnI，純化的cTnI的SDS—PAGE和WesternBlotting結(jié)果均與Sigma公司的cTnI結(jié)果一致。第三部

7、分：目的:采用LICI建立血清cTnI的定量檢測方法。方法:使用兩株特異性的cTnI單克隆抗體，一株包被發(fā)光微粒，另一株進行生物素化，與包被有鏈霉親合素的感光微粒共同構(gòu)成檢測試劑，優(yōu)化檢測條件并評價檢測性能。結(jié)果:方法的分析靈敏度為0．05ng/m1，在L101-29．36ng／m1的范圍內(nèi)線性良好。批內(nèi)和日間變異系數(shù)分別為4．89％一5．93％和6．76％一8．96％。與BiocheckcTnIELISA具有較好的相關(guān)性(r=O．96