溶藻弧菌外膜蛋白DNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及兔抗大黃魚IgM血清制備.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaena Crocea)是我國(guó)單一品種養(yǎng)殖量最大的海水魚類，被農(nóng)業(yè)部確定為我國(guó)六種最具優(yōu)勢(shì)出口水產(chǎn)品之一。然而，隨著人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖大黃魚病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重，其中溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)是養(yǎng)殖大黃魚最常見(jiàn)的病原菌，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病害防治事關(guān)大黃魚養(yǎng)殖成敗和可持續(xù)健康發(fā)展。DNA疫苗作為一種新興的免疫防治手段，在最近幾年內(nèi)發(fā)展較快。DNA疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)

2、作用的有效性已經(jīng)在大范圍的動(dòng)物模型試驗(yàn)中得到了證明，有著良好的應(yīng)用前景。本文以大黃魚為對(duì)象，構(gòu)建了對(duì)大黃魚養(yǎng)殖和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的溶藻弧菌的外膜蛋白W的真核表達(dá)重組DNA，同時(shí)制備了兔抗大黃魚IgM抗血清，為進(jìn)一步研究溶藻弧菌DNA疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下： 分別用飽和硫酸銨二次鹽析法和蛋白A親和層析法對(duì)健康大黃魚血清中的免疫球蛋白(IgM)進(jìn)行分離純化，所得產(chǎn)物用SDS-pAGE進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：蛋白A親和層析

3、法可以較好地分離到高純度的大黃魚血清IgM，產(chǎn)物的電泳膠中只有重鏈和輕鏈2個(gè)條帶；飽和硫酸銨二次鹽析法除了有這2個(gè)條帶，還有很多雜帶，而且蛋白A親和層析法更為簡(jiǎn)便、快速，因此用蛋白A親和層析法分離純化IgM優(yōu)于飽和硫酸銨二次鹽析法；大黃魚免疫球蛋白重鏈的分予量在76kOat左右；輕鏈分子量在28kDa左右。用純化的大黃魚IgM免疫實(shí)驗(yàn)兔，獲得效價(jià)高達(dá)1:40960的兔抗魚IgM血清。本文所建立的蛋白A親和層析法提取大黃魚血清IgM可以方

4、便、快捷地獲得高純度的產(chǎn)物，適合在實(shí)驗(yàn)室中純化魚類IgM。本研究所制備的兔抗大黃魚IgM血清為今后的相關(guān)研究工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 細(xì)菌外膜蛋白被認(rèn)為具有較強(qiáng)的抗原性，本文選定溶藻弧菌外膜蛋白w(GetleBarlk編號(hào)AY944132)為抗原基因設(shè)計(jì)引物，基因大小642個(gè)堿基，上游引物5’端加入HindⅢ酶切位點(diǎn)，下游引物5’端加入ECOV Ⅰ酶切位點(diǎn)。用PCR法克隆了溶藻弧菌外膜蛋白W基因，退火溫度為45℃。經(jīng)l％瓊脂糖電泳

5、檢測(cè)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期相符，測(cè)序檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物與溶藻弧菌外膜蛋白w基因序列的同源性為98％。以DcDNA3.1(+)為真核表達(dá)載體，與PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切后，以T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組子。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，經(jīng)氨卞青霉素篩選后，取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒雙酶切后，通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)證明插入片斷大小正確，測(cè)序結(jié)果同源性為98％，至此成功構(gòu)建溶藻弧菌外膜蛋白w的真核表達(dá)載體并命名為pcDNA3.1(+)-