野生型VHL基因提高腎細胞癌細胞786-O對TRAIL敏感性的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 實驗研究野生型 VHL基因提高腎細胞癌細胞株786-O對 TRAIL敏感性的基礎研究
　　目的:91％的散發(fā)性腎細胞癌患者中存在腫瘤抑制基因 von Hippel-Lindau(VHL)的突變或失活。VHL基因以及翻譯的產物 pVHL能夠在轉錄和翻譯水平調節(jié)多種與腎細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因的表達,但與 TRAIL介導的腫瘤細胞凋亡之間的關系并不明確,本次研究的目標是在腎細胞癌78

2、6-O細胞株上明確野生型 VHL基因在 TRAIL介導的腫瘤細胞凋亡中的作用。
　　方法:選用腎細胞癌786-O細胞株、單克隆攜帶野生型 VHL基因全長 DNA的786-O/VHL細胞以及單克隆攜帶 VHL基因不同類型突變 DNA的786-O細胞,采用不同濃度的人重組 TRAIL和40ug/ml的TRAIL作用不同的時間,利用MTT和流式細胞術來檢測上述細胞株對 TRAIL介導腫瘤細胞凋亡的敏感性以及野生型 VHL基因是否具有提高

3、786-O細胞對 TRAIL敏感性的能力。RT-PCR和Western-Blot用于分析死亡受體 DR4、DR5以及凋亡抑制蛋白 c-FLIP(L)在轉錄和翻譯的表達水平。為了準確闡明 c-FLIP(L)和TRAIL介導786-O/VHL細胞凋亡的相關性,用脂質體2000將 c-FLIP(L)轉染到對 TRAIL敏感的786-O/VHL細胞中,觀察高表達的c-FLIP(L)和TRAIL敏感性的關系。同時利用DR4和DR5的拮抗抗體來觀察

4、兩種死亡受體和野生型 VHL基因的關系。
　　結果:MTT檢測表明表達野生型 VHL基因的786-O/VHL細胞對 TRAIL介導的凋亡敏感,且存在劑量和時間依賴性,其余細胞株表現出對 TRAIL耐受。流式細胞儀結果表明:TRAIL(40ng/ml)處理24h后786-O/VHL細胞和786-O細胞發(fā)生凋亡的比率分別為30％和9％(P<0.05),處理72h后凋亡的比率分別為50％和10％(P<0.01)。RT-PCR和Weste

5、rn blot檢測表明,相對于對 TRAIL耐受的786-O細胞,表達野生型 VHL基因的786-O/VHL細胞在轉錄和翻譯水平 DR4的表達顯著上調, DR5和c-FLIP(L)的表達顯著下降。質粒轉染后高表達 c-FLIP(L)的786-O/VHL細胞從 TRAIL敏感轉變?yōu)門RAIL耐受(P<0.05)。為了進一步證實 DR4和FR5的表達水平變化與 TRAIL敏感性的相互關系,利用DR4和DR5拮抗抗體分別特異性地阻斷 DR4和

6、DR5介導的TRAIL信號通路。結果發(fā)現:DR5被阻滯后,786-O/VHL細胞仍然對 TRAIL介導的細胞凋亡敏感;而DR4被阻滯后,786-O/VHL細胞從對 TRAIL介導的細胞凋亡敏感轉換為耐受(P<0.05);同時聯合應用DR4和DR5的拮抗抗體,其結果與單獨阻斷 DR4的結果相似(P<0.05)。
　　結論:相對于 TRAIL耐受的786-O細胞,表達野生型 VHL基因的786-O/VHL細胞在轉錄和翻譯水平提高了死亡

7、受體 DR4的表達和降低了凋亡抑制蛋白 c-FLIP(L)的表達。應用DR4拮抗劑和高表達的c-FLIP(L)基因后的786-O/VHL細胞從 TRAIL敏感轉變?yōu)門RAIL耐受。上述的結果闡明了野生型 VHL基因可以使 TRAIL抵抗的786-O細胞敏感化,其他突變類型的VHL沒有類似作用。并且 VHL基因導入786-O細胞后的DR4受體表達水平上升和c-FLIP(L)表達水平下調是導致786-O/VHL細胞對 TRAIL敏感的重要分

8、子機制。
　　第二部分 綜述
　　VHL-HIF-VEGF信號通路和腎細胞癌
　　VHL基因定位于染色體3p25～26,其產物 pVHL與一些信號通路、缺氧誘導因子、氧化磷酸化的調控有關。VHL基因的失活可導致 VHL-HIF-VEGF信號通路異常,這與腎細胞癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。VHL基因的失活機制主要包括基因突變,雜合性缺失和甲基化。針對 VHL-HIF-VEGF信號通路的靶向治療現已在臨床上廣泛的應用。通