瘦素誘導(dǎo)的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制研究.pdf

1、目的：近年來(lái)，乳腺癌被認(rèn)為是一種內(nèi)分泌相關(guān)性腫瘤，而肥胖是己知的乳腺癌的危險(xiǎn)因素,但肥胖參與乳腺癌發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明。以往的研究提示，肥胖患者存在高水平表達(dá)的多種內(nèi)分泌激素，其中，瘦素(leptin)被認(rèn)為和乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)分泌激素，它通過(guò)其特異性受體發(fā)揮效應(yīng)。多項(xiàng)研究提示瘦素可以通過(guò)JAK2/STAT3(信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子)信號(hào)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，但是相應(yīng)的分子機(jī)制尚未完全闡明。端粒酶是一種核

2、糖核蛋白酶，其活性主要由其亞單位端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)決定。端粒酶的活化在乳腺癌發(fā)生中起重要作用。由于端粒酶的活化，使端粒的長(zhǎng)度維持一種動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞得以無(wú)限制地增殖下去，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。鑒于hTERT是STAT3的下游靶基因，推測(cè)瘦素亦可通過(guò)STAT3轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)hTERT的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在1)研究人乳腺癌MCF-7細(xì)胞瘦素長(zhǎng)型受體(OBR-b，即功能性受體)和短型受體(OBR-a)的表達(dá)情況2)研究瘦素對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)

3、胞hTERT表達(dá)的影響 3)研究STAT3在瘦素參與的hTERT表達(dá)中的作用，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，揭示瘦素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，為肥胖相關(guān)的乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1)以MCF-7乳腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，培養(yǎng)條件為：含10％ 胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)；將上述細(xì)胞接種于T-75培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％CO2、20％O2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，間隔24

4、小時(shí)或36小時(shí)換液一次，待80％融合時(shí)，胰蛋白酶消化，胎牛血清中和后，離心，培養(yǎng)基童懸，1:3傳代。 2)將MCF-7細(xì)胞接種于六孔板(2X106/孔)，待80％融合時(shí)，Trizol法提取MCF-7細(xì)胞總RNA，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用特異性PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該細(xì)胞系瘦素的長(zhǎng)型受體(OBR-b)和短型受體(OBR-a)的表達(dá)情況； 3)施加重組瘦素50ng/ml和100ng/ml，

5、以β-actin基因表達(dá)為內(nèi)參照，利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法分析瘦素刺激前后hTERT在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況； 4)施加重組瘦素50ng/ml和100ng/ml，以Actin蛋白為內(nèi)參照，利用Western blot方法分析hTERT蛋白在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況； 5)設(shè)計(jì)特異性針對(duì)STAT3的小于干擾RNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后下調(diào)STAT3在乳腺癌中的表達(dá)，半定量RT-PCR法檢

6、測(cè)干擾前后及瘦素刺激前后hTERT的表達(dá)水平的變化。 6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)的顯著性用P值表示。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果：MCF-7細(xì)胞表達(dá)瘦素的長(zhǎng)型受體(OBR-b)和短型受體(OBR-a)mRNA；體外施加瘦素50ng/ml和100ng/ml刺激MCF-7細(xì)胞12小時(shí)，hTE

7、RT mRNA增加3.2±0.5倍(P<0.01)和2.7±0.3倍(P<0.01)，蛋白上調(diào)2.8±0.8倍(P<0.05)和2.5±0.7倍(P<0.05)。合成兩條特異性小干擾RNA，經(jīng)Western blot分析，這兩條小片段都可特異地、有效地下調(diào)STAT3表達(dá)。利用半定量RT-PCR分析，伴隨著STAT3表達(dá)的下調(diào)，hTERT表達(dá)也隨之下調(diào)。更重要的是，當(dāng)STAT3表達(dá)下調(diào)以后，瘦素上調(diào)hTERT表達(dá)的作用即被消除。

8、結(jié)論：通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)我們得到如下結(jié)論：1)MCF-7細(xì)胞表達(dá)功能型瘦素受體，這樣可以接收瘦素給予的信號(hào)。2)瘦素可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)MCF-7細(xì)胞hTERT基因的表達(dá)　3)瘦素亦在蛋白水平上調(diào)MCF-7細(xì)胞hTERT的表達(dá)　4)瘦素上調(diào)hTERT表達(dá)的效應(yīng)是通過(guò)STAT3介導(dǎo)的。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們推測(cè)在肥胖導(dǎo)致的乳腺癌患者中，由于高瘦素的表達(dá)，作用于乳腺癌細(xì)胞表面的受體，通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)途徑活化hTERT基因，進(jìn)而活化端粒酶