中國(guó)HIV-AIDS患者naive、memory CD8+T細(xì)胞亞群數(shù)量及功能與疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究.pdf

1、CD8+T細(xì)胞在抗人類免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus，HIV)感染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其中naive CD8+T細(xì)胞沒(méi)有接受過(guò)抗原刺激，對(duì)人體產(chǎn)生針對(duì)新抗原的免疫應(yīng)答非常重要，受抗原刺激后，能迅速活化、增殖，并分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞。Memory CD8+T細(xì)胞對(duì)機(jī)體產(chǎn)生快速二次免疫應(yīng)答和維持機(jī)體免疫平衡具有重要作用。目前，有關(guān)naive和memory CD8+T細(xì)胞，尤其是TEM-2型CD8+T

2、細(xì)胞在HIV感染者體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化、免疫作用機(jī)制及在抗病毒治療、疫苗研制中的作用尚不明確，HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者的系統(tǒng)報(bào)道甚少，尚無(wú)中國(guó)HIV感染者及HAART治療患者不同亞群memory T細(xì)胞的研究。以往多以CD45RA和CD62L作為標(biāo)志測(cè)定naive、memory T細(xì)胞數(shù)量，本課題在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用多色流式細(xì)胞儀，運(yùn)用多參數(shù)(CD45RA、CCR7、CD28)進(jìn)一步明確定義naiVe、memory T細(xì)胞及其不同亞群，研究不同疾病

3、進(jìn)展階段的中國(guó)HIV感染者naive、memory T細(xì)胞數(shù)量變化及其活化、增殖、受體表達(dá)情況，并探討這些指標(biāo)與疾病進(jìn)展及免疫功能的相關(guān)性。 方法: 1、研究對(duì)象 58例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者來(lái)自中國(guó)遼寧、吉林和河南，其中男性28例，女性30例，年齡分布為30-68歲(40.7±9.2)。根據(jù)HIV感染時(shí)間和CD4+T細(xì)胞數(shù)量將上述患者分為HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展組、典型進(jìn)展HIV組和典型進(jìn)展AIDS組

4、。58例HIV/AIDS患者中LTNP18例、HIV感染者20例、AIDS患者20例。20例健康對(duì)照為隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人，其中男性10名，女性10名。 2、T細(xì)胞絕對(duì)值檢測(cè) 將20 μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，經(jīng)反向加樣法加入50 μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450 μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACS MultiSET軟件檢測(cè)并進(jìn)

5、行自動(dòng)分析，計(jì)算CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。 3、HIV病毒載量檢測(cè) 采用RT-PCR方法，用美國(guó)Roche公司的COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x測(cè)定病毒載量，最低檢測(cè)范圍是400拷貝/ml。 4、Naive、memory CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 取HIV-1感染者及健康人全血100 μl，應(yīng)用以下熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色：CD28-FITC/CD27.PE/CD8.PerCP/CD45RA.APC

6、/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7，室溫孵育30min。加入溶血素3ml，室溫孵育8min，1200r/min離心5min，棄上清。加入3ml PBS洗滌兩次，加入含1％多聚甲醛的PBS 200μl重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、CD8-PerCP、CD45RA-PE-cy7、CCR7-PE-Cv7定義naive、memory CD8+T細(xì)胞，計(jì)算這些細(xì)胞群的百分比。 5、N

7、aive、memory CD8+T淋巴細(xì)胞表面CCR5、CXCR4及CD38水平的檢測(cè) 取HIV/AIDS患者及健康人全血100 μl，應(yīng)用以下熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色：CD28-FITC/CCR5-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7、CD28-FITC/CXCR4-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7和CD28-

8、FITC/CD38-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7，室溫避光染色30min。加入溶血素3毫升，室溫避光10分鐘，1200r/min離心5min，棄上清。加入ml PBS洗滌兩次，加入1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。 6、CD4+、CD8+T細(xì)胞及其亞群內(nèi)ki67水平檢測(cè) 密度梯度離心法分離HIV-1感染者及健康人PB

9、MC。向流式管1×106 PBMC中加入anti-CD28-FITC、anti-CD8-PerCP、anti-CD45RA-APC、anti-CCR7-PE-cy7和anti-CD4-APC-Cy7各10＃1，4℃避光染色25 min，用冷的PBS 2ml洗滌1次(1200r/min離心5min)。應(yīng)用BD細(xì)胞破膜固定試劑盒(BD cytofix/cytoperm kit)，加入500μl Fixation/Permeabilizati

10、on solution，室溫避光20 min，離心棄上清，加入2mlBD Perm/Wash buffer，室溫避光10 min，離心棄上清，加入100μl BD Perm/Washbuffer重懸。加入anti-ki67-PE及IgGl-PE同型對(duì)照，室溫避光30 min。2ml BDPerm/Wash buffer洗滌后棄上清，300μl PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、CD4-APC-

11、Cy7、CD8-PerCP、CD45RA-PE-cy7、CCR7-PE-Cy7定義naive、memory CD4+、CD8+T細(xì)胞，計(jì)算這些細(xì)胞群內(nèi)ki67表達(dá)百分比。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSSl3.0軟件包對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 各組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用方差分析，各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、Naive

12、、memory CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化及與疾病進(jìn)展的關(guān)系： 通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Naive CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞顯著正相關(guān)(P<0.01)，與HIV病毒載量顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；TCM、TEM-2型CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞顯著正相關(guān)(P<0.01)，但與HIV病毒載量無(wú)關(guān)(P>0.05)；TEM-l型CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞及病毒載量均無(wú)關(guān)(P>0.05)。 2、HAART治療對(duì)naive、m

13、emory CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的影響： HAART治療后，HIV/AIDS患者naive、TEM-2型CD8+T細(xì)胞百分比和絕對(duì)值均顯著升高(P<0.01)，TEM-1型CD8+T細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.01)。 3、Naive、memory CD8+T細(xì)胞表面趨化因子受體CCR5、CXCR4表達(dá)水平及與疾病進(jìn)展、T細(xì)胞亞群數(shù)量的相關(guān)性： 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，(1)naive、TCM及TEM-2型CD8+T細(xì)

14、胞表面CCR5表達(dá)與CD4+T細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，TcM型CD8+細(xì)胞表面CCR5表達(dá)與HIV病毒載量顯著正相關(guān)(P<0.05)；TEM-1型CD8+T細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)與CD4+T細(xì)胞顯著正相關(guān)(P<0.05)，與HIV病毒載量顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。(2)Naive CD8+T細(xì)胞數(shù)量與其表面CCR5表達(dá)的百分率顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，TEM-2型CD8+T細(xì)胞數(shù)量與其表面CCR5、CXCR4表達(dá)的百分率顯著

15、負(fù)相關(guān)(P<0.05)。 4、中國(guó)HIV/AIDS患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及其亞群增殖、活化及與疾病進(jìn)展的相關(guān)性 LTNP組、HIV組及AIDS組中，naive、memory CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群內(nèi)ki67表達(dá)均依次升高，AIDS組naive、TcM、TEM-1型CD4+、CD8+T細(xì)胞及TEM-2型CD4+T細(xì)胞內(nèi)ki67表達(dá)均顯著高于LTNP組(P<0.01)；LTNP組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.0

16、5)。從亞群分布看，naiveT細(xì)胞ki67表達(dá)率約增加2-4倍，memoryT細(xì)胞約增加3-5倍。 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CD4+、CD8+T細(xì)胞內(nèi)ki67表達(dá)與CD4+T細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與HIV病毒載量顯著正相關(guān)(P<0.01)，與CD4+、CD8+T細(xì)胞表面CD38水平顯著正相關(guān)(P<0.05)。CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞之間ki67表達(dá)顯著正相關(guān)(P<0.01)。 結(jié)論: 1.中國(guó)HIV/A

17、IDS患者naive CD8+T細(xì)胞顯著減少，memory CD8+T細(xì)胞顯著增加，以TEM-1表型為主，TEM-2表型隨疾病進(jìn)展進(jìn)行性減少。Naive、memoryCD8+T細(xì)胞數(shù)量與中國(guó)HIV/AIDS患者疾病進(jìn)展顯著相關(guān)。 2.中國(guó)LTNP者TEM-2型CD8+T細(xì)胞顯著高于AIDS患者，而且顯著高于健康對(duì)照，提示TEM-2型CD8+T細(xì)胞對(duì)HIV感染后疾病延緩進(jìn)展具有保護(hù)作用。 3.HAART治療使naive、T