慢性胃炎脾虛證患者基因差異表達(dá)圖譜研究.pdf

1、研究背景和目的20世紀(jì)50年代中期，一批名老中醫(yī)分別撰文，全面闡述和介紹了辨證論治體系，確立了辨證論治在整個(gè)中醫(yī)診療體系中的特殊地位。證在中醫(yī)理論中的獨(dú)特性和重要性得到了學(xué)術(shù)界的認(rèn)同。隨之，對(duì)證候的研究、證本質(zhì)的研究開始進(jìn)行。到70年代中期，證本質(zhì)研究進(jìn)入了全面鋪開的時(shí)期。進(jìn)入80年代后，研究逐步深入，如血瘀證、脾虛證、腎虛證等研究都進(jìn)行得比較廣泛。 脾虛證作為中醫(yī)證侯研究中一個(gè)有代表性的領(lǐng)域，一直是中西醫(yī)結(jié)合研究的熱門課題之一

2、，被列入國家“七五”重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目和軍隊(duì)“七五”攻關(guān)課題。已進(jìn)行的研究以消化系統(tǒng)為主，涉及免疫、能量代謝、肌肉運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌、甚至基因水平等方面，取得了一定成就。 中醫(yī)理論認(rèn)為脾主運(yùn)化，運(yùn)化水谷精微和水濕，脾主統(tǒng)血，脾為氣血生化之源，脾為后夭之本，四季脾旺不受邪，脾主思，脾主四肢肌肉，開竅于口，其華在唇等。脾的生理功能所涉及的廣泛性，就表明了脾的病理也不會(huì)局限于一病一癥一臟器。同時(shí)，脾與五臟六腑的關(guān)系，“內(nèi)傷脾胃，百病由生

3、”等，說明脾胃損傷會(huì)引起很多疾病的發(fā)生，脾病會(huì)引起很多臟器系統(tǒng)的病變，而很多疾病、臟器病變也會(huì)引起脾病的發(fā)生。因此，脾虛證涉及的面也相當(dāng)廣泛。它可以出現(xiàn)在內(nèi)、外、婦、兒、腫瘤、皮膚、耳鼻喉、老年病等各科疾病中；它本身可以涉及到消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肌肉運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)等各個(gè)系統(tǒng)的方面的變化。對(duì)于這樣一個(gè)龐雜的體系，無序的研究只會(huì)造成混亂。任何單一方面的檢測指標(biāo)也都只能反映宏觀概念中的一部分或某一點(diǎn)，而不可能是證

4、的全部。 為了使對(duì)脾虛證的研究進(jìn)行的有序而深入，并最終形成一個(gè)綜合的輪廓，有必要采用病與證相結(jié)合的研究方法。在理論認(rèn)識(shí)和已有的研究中，脾虛證可以出現(xiàn)在多個(gè)系統(tǒng)多種疾病的病變中，但一般以消化系統(tǒng)功能紊亂為主要表現(xiàn)的觀點(diǎn)得到大多數(shù)研究者的認(rèn)同，而慢性胃炎是消化系統(tǒng)最常見的疾病，慢性胃炎患者有相當(dāng)大的比例(有報(bào)道為1/3左右)可表現(xiàn)為脾虛。因此，我們的研究把范圍限定在慢性胃炎脾虛證，從而使研究的切入點(diǎn)更加明確，在臨床病例的入選上也更加

5、容易確定和甄別。 在已有的眾多參考指標(biāo)中，從分子層面進(jìn)行揭示的不多，深入到基因水平的更少。而隨著人類認(rèn)識(shí)水平的提高，隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，大量研究資料表明，人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展都與某些相應(yīng)的基因出現(xiàn)異常的擴(kuò)增、重排、缺失、突變、功能異?；虮磉_(dá)異常有關(guān)；其中，基因表達(dá)水平的變化反映了機(jī)體特定階段的生命特征。研究表明不同的病或者證可能大多存在有其不同的基因組學(xué)基礎(chǔ)和背景。 目前國內(nèi)許多專家比較認(rèn)可的是，人類基因組學(xué)

6、的方法學(xué)內(nèi)容與中醫(yī)整體觀、辨證觀有許多相似之處。脾虛證作為一系列復(fù)雜臨床癥狀和體征的集中描述，在這些表象背后，應(yīng)該有其特定的生物學(xué)基礎(chǔ)。就是說，可能有支持它的相應(yīng)基因組學(xué)背景，脾虛證可能具有相關(guān)基因的差異表達(dá)。本課題試圖描繪出脾虛證的基因差異表達(dá)圖譜。 在中醫(yī)證侯研究中，一直比較強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)就是，在對(duì)證的研究中要重視病與證的結(jié)合。脾虛證的研究亦是如此。因此，如前所述，我們的研究選擇了慢性胃炎作為研究對(duì)象，把研究的目標(biāo)鎖定到慢性胃炎

7、脾虛證。同時(shí)，對(duì)中醫(yī)的同病異證的理論基礎(chǔ)進(jìn)行探討，實(shí)驗(yàn)選擇慢性胃炎的脾虛證和脾胃濕熱證進(jìn)行對(duì)照研究，探討同一慢性胃炎兩種不同證型的基因表達(dá)差異。 研究方法1、病例選擇受試病例首先需要符合慢性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(臨床、胃鏡及病理診斷)，然后符合脾虛證/脾胃濕熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)要排除消化道器質(zhì)性病變及其他系統(tǒng)嚴(yán)重病變者。 脾虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)：主癥：①舌質(zhì)淡、舌體胖或有齒印，苔薄白；②胃納減少或食欲差；③腹脹；④大便溏或腹瀉；次癥：①消

8、瘦；②體倦乏力；③脈細(xì)弱。判斷：1)主癥①必備。2)兼具主癥②、③、④之二；或兼具主癥②、③、④之一，同時(shí)兼具兩個(gè)以上次癥，診斷即可成立。 脾胃濕熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)：主癥：①舌苔黃膩；②胸悶；③胃脘痞滿或脹痛；④食欲不振。次癥：①口苦而粘；②口渴而少飲，或喜熱飲；③大便溏，或有粘液；④惡心；⑤身困乏力；⑥脈濡緩，或滑。判斷：1)主癥①必備。2)兼具主癥②、③、④之二，或兼具主癥②、③、④之一，同時(shí)兼具兩個(gè)以上次癥；或兼具3個(gè)以上次癥，

9、診斷即可成立。 正常健康者選擇標(biāo)準(zhǔn)：臨床辨證無明顯異常，舌象脈象正常。胃鏡下及病理檢查胃粘膜無明顯病變者。 2、收集標(biāo)本在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院按照上述標(biāo)準(zhǔn)收集慢性淺表性胃炎脾虛證患者作為試驗(yàn)組(脾虛)，慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證患者作為證型對(duì)照組(脾胃濕熱)，從志愿者中選擇健康人作為正常對(duì)照組(正常)。于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃鏡室做胃鏡檢查。經(jīng)胃鏡下診斷也符合納入標(biāo)準(zhǔn)后，胃鏡下鉗夾胃竇部和十二指腸

10、粘膜組織3至4塊，生理鹽水(RNase-free)清洗后，取一塊置于10％福爾馬林液中備做病理切片，其余于置于RNAlater中，液氮保存，以備制作表達(dá)譜芯片BiostarH-140s。 3總RNA提取將液氮保存的樣品用碾缽碾磨成粉末狀后，轉(zhuǎn)移至已經(jīng)加入適量UNIzol試劑的勻漿管中勻漿。將勻漿液4℃，12000g，離心10min。小心吸取上清液，15～30℃放置5min。加入氯仿，震蕩，15～30℃放置3min，4℃，1200

11、0g，離心15min。吸取上清，加入異丙醇，充分混勻，15～30℃，放置10min，4℃，12000g，離心10min。棄去上清，緩慢加入75％乙醇5ml，洗滌，小心棄去乙醇。再加入75％乙醇10ml，短暫渦旋，4℃，8000g離心10min。小心棄上清，短暫離心，吸去上清，干燥沉淀5min。加入RNase-free的Milli-Q水，完全溶解RNA沉淀后，取適量RNA采用核酸定量分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，余-80℃保存。

12、 4探針標(biāo)記按照UNIGENE芯片雜交試劑盒說明書操作如下：將配制好的預(yù)雜交液放入95℃水浴鍋內(nèi)變性2min，將待預(yù)雜交的玻片放入95℃水浴鍋內(nèi)變性30sec。將預(yù)雜交液加到玻片內(nèi)，放入雜交箱內(nèi)42℃預(yù)雜交5～6hr。依次加入以下試劑(反應(yīng)終體積為50μl，以下試劑均為RNase-free)：23μlddH2O，5μl逆轉(zhuǎn)錄引物，30～50μg總RNA，振蕩混勻，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。分別加入以下試劑：10μl

13、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，5μlDTT，4μldNTPs。在暗室中加入以下試劑：2μl逆轉(zhuǎn)錄酶，脾虛加3μlCy5-dCTP(正常加3μlCy3-dCTP)，混勻樣品，手浴2min。42℃水浴2hr。依次加入標(biāo)記試劑Ⅰ4μl，65℃水浴10min后加入標(biāo)記試劑Ⅱ4μl?；靹颍喜?duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。避光，真空抽干至50μk左右。純化DNA。加入標(biāo)記試劑Ⅲ8μl，真空抽干。 5芯片雜交在抽干的探針管中加6.5μk雜交試劑Ⅰ，混勻。再加入6.5μ

14、k雜交試劑Ⅱ，混勻。將探針置于95℃水浴中變性2min；玻片置于95℃水浴中變性30sec，將探針置于芯片上，置于雜交艙中，42℃雜交過夜(16～18h)。 6洗片掃描用0.5％的洗滌液1沖洗玻片，將玻片依次浸入染色缸中洗滌10min。用0.5％的洗滌液1沖洗玻片，晾干。用ScanArray3000掃描儀掃描芯片，觀察雜交結(jié)果，用ImaGene3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。 7芯片分析7.1對(duì)所有

15、基因的Cy5、Cy3熒光信號(hào)強(qiáng)度值和Cy5/Cy3的比值Ratio進(jìn)行分析，設(shè)定判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)Cy5/Cy3的Ratio≥2，或≤0.5；(2)Cy3或Cy5信號(hào)值其中之一必須＞800；(3)6張芯片中至少有4張滿足條件(1)和(2)，即n≥4。滿足三個(gè)條件的基因即為兩組標(biāo)本之間的基因差異表達(dá)圖譜。 7.2對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析 7.3比對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)篩選出的差異表達(dá)基因，尋找兩組結(jié)果中一致的基

16、因 7.4對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因，取其在所有芯片的熒光值做t檢驗(yàn)，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，p＜0.05為有表達(dá)差異的基因，p＜0.01為顯著表達(dá)差異的基因。 8RealtimePCR綜合芯片分析結(jié)果，對(duì)顯著表達(dá)差異的基因，進(jìn)行熒光定量PCR檢測其表達(dá)水平。 結(jié)論1、慢性胃炎脾虛證與正常健康人比較，存在有胃粘膜基因差異表達(dá)特征圖譜。主要包括與代謝、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、免疫、平滑肌運(yùn)動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)的基因。

17、 2、慢性胃炎脾虛證與慢性胃炎脾胃濕熱證比較，存在有胃粘膜基因差異表達(dá)特征圖譜。主要包括與消化吸收相關(guān)酶、炎癥、生長發(fā)育、細(xì)胞周期等相關(guān)的基因。 3、經(jīng)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)部分基因芯片技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因的再檢測，與芯片結(jié)果有一定的復(fù)合度(61.8％)。 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示脾虛證存在有差異表達(dá)基因組學(xué)背景，可以作為脾虛證臨床研究和證本質(zhì)研究的參考。發(fā)現(xiàn)的若干基因可以進(jìn)一步進(jìn)行蛋白表達(dá)等方面的深入研究。實(shí)驗(yàn)病例入選標(biāo)準(zhǔn)