水蛭DNA鑒定、活性多肽分離及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、廣義水蛭通常是指環(huán)節(jié)動(dòng)物門(Annelida)蛭綱(Hirudinea)一類動(dòng)物的總稱。作為中藥，從《神農(nóng)本草經(jīng)》開始記載使用，迄今已有3000多年的歷史。中醫(yī)對瘀血的定義是指體內(nèi)血液停積而形成的病理產(chǎn)物，凡能影響血液正常運(yùn)行，引血液運(yùn)行不暢，致血離經(jīng)脈而瘀積的內(nèi)外因素，均可導(dǎo)致瘀血形成。中醫(yī)論述水蛭的性味、功效和主治為：味咸平，可破血、逐瘀、通經(jīng)，治蓄血、癥瘕積聚、婦女經(jīng)閉、干血成癆、跌撲損傷等證。水蛭的功效與其抗凝血作用密切相關(guān)。凝

2、血是機(jī)體重要的生理防御過程，但病理性凝血即血栓形成導(dǎo)致血行不暢，在心腦血管疾病的惡化中起著關(guān)鍵的作用，因此，抗血栓和抗凝血是治療心腦血管疾病的重要方法之一。水蛭中發(fā)現(xiàn)的最重要的、療效最好的抗凝血活性物質(zhì)是水蛭素（Hirudin），水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凝血酶抑制劑。
　　水蛭作為中藥，中醫(yī)臨床使用歷史悠久，其活血化瘀功效確切，但仍有很多中醫(yī)藥用的基礎(chǔ)理論問題尚未研究清楚。如1、藥用品種問題。中國藥典中藥水蛭的來源僅有三種，廣義水

3、蛭是環(huán)節(jié)動(dòng)物門蛭綱動(dòng)物的總稱，有什么較好的辦法能將形態(tài)類似的動(dòng)物加以區(qū)分，以保證中藥水蛭的品種來源及臨床療效？2、療效藥用物質(zhì)基礎(chǔ)問題。水蛭素等活性物質(zhì)只能在活體的日本醫(yī)蛭分泌物中提取，干燥和加熱后就會受到破壞。而中醫(yī)臨床藥用水蛭使用其干燥體，用水煎煮甚至炮制后服用，這是否還具有活血化瘀或抗凝血作用？在不吸血的寬體金線蛭中并不含水蛭素，寬體金線蛭作為中藥水蛭的主流商品，是否含有抗凝血的活性物質(zhì)？其抗凝血活性成分有哪些？其抗凝血作用機(jī)制與

4、哪些因素相關(guān)？3、資源緊張問題。近年來市場需求不斷上漲，中藥水蛭尤其是日本醫(yī)蛭的資源極度緊缺，究竟古代藥用水蛭品種與現(xiàn)代藥用品種有什么不同？什么水蛭的品種可作為新的水蛭資源品種進(jìn)行替代研究？4、質(zhì)量評價(jià)問題。抗凝血活性是中藥水蛭活血化瘀功效的藥理學(xué)基礎(chǔ)，但目前中國藥典中水蛭抗凝血活性的測定方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性欠佳，期待尋找更為合理的方法用于檢測水蛭藥材的抗凝血活性，以確保其臨床療效。這些都是中藥水蛭在臨床應(yīng)用中所亟待解決的中醫(yī)基礎(chǔ)理論問題

5、。
　　為研究上述問題，本文在不同物種水蛭的分子生物學(xué)鑒定；在寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭及菲牛蛭抗凝活性成分的分析、分離及鑒定；在寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭及菲牛蛭的抗凝血體外作用機(jī)制初探；在抗凝血活性的生物檢定等方面，進(jìn)行了廣泛而深入的研究。通過研究，發(fā)現(xiàn)了一些新的抗凝血活性肽及其作用機(jī)制，尤其在寬體金線蛭的研究方面，較前人有較多新的進(jìn)展。
　　采用分子生物學(xué)技術(shù)，擴(kuò)增得到寬體金線蛭、菲牛蛭、日本醫(yī)蛭、尖細(xì)金線蛭、光潤金線蛭、棒紋牛蛭

6、、日本山蛭及八目石蛭等8個(gè)物種的ITS2、COⅠ、12SrRNA、16SrRNA等基因片斷的序列，比較此4個(gè)基因片斷候選序列種內(nèi)種間差異；利用Wilcoxon Two Sample Tests檢驗(yàn)，考察候選序列種間、種內(nèi)變異的barcoding gap；并結(jié)合鑒定成功率，得到12SrRNA為醫(yī)用蛭類較為合適的DNA條形碼序列。并提出應(yīng)用COⅠ及12SrRNA聯(lián)合序列在種內(nèi)保守而種間差異較大的片段設(shè)計(jì)特異引物，是準(zhǔn)確鑒別水蛭藥材真?zhèn)蔚睦硐?/p>

7、方法。
　　采用凝膠柱色譜聯(lián)合制備高效液相色譜的方法，依據(jù)中醫(yī)臨床的使用特點(diǎn)，首次從寬體金線蛭中分離得到一個(gè)耐熱、具抗凝血活性的多肽成分，分子量為9374，并分析其含分子量為1832的糖鏈，屬于糖肽類化合物，對寬體金線蛭藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有了初步的闡釋。
　　用液質(zhì)聯(lián)用的方法，對日本醫(yī)蛭及菲牛蛭中抗凝血活性多肽類成分進(jìn)行了研究，分析得到日本醫(yī)蛭3個(gè)多肽類成分，分子量為14998、15988、15956；菲牛蛭中分析得到6個(gè)多肽類成

8、分，9590、13642、14998、17631、15988、16567。其中日本醫(yī)蛭與菲牛蛭有兩個(gè)成分具有相同的分子量，且此兩成分為活性多肽部位主要的成分峰。從活性成分角度而言，菲牛蛭作為水蛭新來源是完全可以的。用胰蛋白酶酶切結(jié)合MarkerLnyx軟件分析的方法，找到日本醫(yī)蛭與菲牛蛭區(qū)別的特征識別肽。
　　采用體外培養(yǎng)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的方法，分析了寬體金線蛭與凝血酶、凝血因子Ⅶ以及凝血因子Ⅸ的作用，初步認(rèn)為寬體金線蛭抗凝血作用位點(diǎn)

9、與凝血因子Ⅶ有關(guān)；對比了寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛蛭及棒紋牛蛭與凝血酶的作用，認(rèn)為后三者均與凝血酶有作用，但寬體金線蛭抗凝血作用位點(diǎn)是與凝血酶、凝血因子Ⅶ等多個(gè)位點(diǎn)相關(guān)，體現(xiàn)了水蛭作用多靶點(diǎn)整體性的特點(diǎn)，這一特點(diǎn)既符合中醫(yī)整體觀念，又符合中藥多成分多靶點(diǎn)作用模式。
　　將生物檢定技術(shù)應(yīng)用于水蛭抗凝血活性的測定，探討反映水蛭生物活性的質(zhì)量控制方法。采用肝素鈉作為對照品，選擇APTT值作為抗凝活性評價(jià)依據(jù)，對寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛

10、蛭、棒紋牛蛭的抗凝活性進(jìn)行測定，測定結(jié)果分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和生物檢定統(tǒng)計(jì)法計(jì)算。4種水蛭APTT法的量效關(guān)系曲線與肝素的量效關(guān)系曲線類似，突躍范圍呈平行關(guān)系，上述特點(diǎn)符合生物檢定的要求，說明以肝素鈉作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用生物檢定技術(shù)APTT法測定水蛭等樣品的抗凝活性是可行的。APTT值可以全面反映水蛭的抗凝血作用，測定結(jié)果對臨床使用更具指導(dǎo)意義。生物檢定技術(shù)應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價(jià)，符合中醫(yī)整體作用、協(xié)同作用的觀點(diǎn)，是對現(xiàn)有中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法良好的

11、補(bǔ)充。
　　本文通過研究，整合DNA分子標(biāo)記技術(shù)、LC-MS色譜聯(lián)用技術(shù)、生物檢定技術(shù)等現(xiàn)代分析手段，使用各種計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)作數(shù)據(jù)分析處理，分別從鑒定、分離、分析、質(zhì)量評價(jià)等方面構(gòu)建了含動(dòng)物活性多肽類的中藥研究的先進(jìn)技術(shù)平臺，為動(dòng)物類中藥的研究建立了一個(gè)系統(tǒng)研究的模式；突出了生物檢測技術(shù)作為中藥質(zhì)量評價(jià)與控制的發(fā)展方向，采用同一APTT法評價(jià)不同活性強(qiáng)度不同水蛭品種的抗凝活性，解決了水蛭原有的凝血酶滴定法對不同品種測定評價(jià)方法不統(tǒng)