外源性BMSCs在小鼠實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎TMJ軟骨中存活、定植和分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種發(fā)病率較高的關(guān)節(jié)疾病,以軟骨退變和軟骨下骨異常改建為主要病理表現(xiàn)。顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibularjoint,TMJ)是OA好發(fā)部位之一。骨性關(guān)節(jié)炎所造成的軟骨退變,采用傳統(tǒng)治療方法很難自行完善修復(fù),而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能,在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為軟骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以本課題組

2、所建的咬合紊亂致小鼠髁突軟骨退行性變模型為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)外源性BMSCs向病變髁突軟骨遷移、定植、分化的特征。
　　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
　　1.實(shí)驗(yàn)性單側(cè)前牙反牙合致小鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突骨關(guān)節(jié)炎樣變動(dòng)物模型的建立:
　　將第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的60只6周齡雌性C57BL6小鼠,隨機(jī)、等量分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組小鼠左側(cè)上、下前牙粘接統(tǒng)一規(guī)格金屬不良修復(fù)體,造成左側(cè)前牙反牙合的異常咬合接觸。對(duì)照組小鼠進(jìn)行對(duì)照操作

3、,給予同樣的飼養(yǎng)環(huán)境至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)室開始后3w處死動(dòng)物,取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)后常規(guī)脫鈣,石蠟包埋,進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)染色以及形態(tài)學(xué)的測(cè)量。HE染色顯示,對(duì)照組髁突軟骨表面光滑連續(xù),細(xì)胞排列整齊。實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨出現(xiàn)明顯退變,表現(xiàn)為軟骨厚度變薄,軟骨細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞排列紊亂,個(gè)別出現(xiàn)明顯的無細(xì)胞區(qū);甲苯胺藍(lán)染色顯示的蛋白多糖表達(dá)明顯低于對(duì)照組;軟骨下骨的骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度明顯低于對(duì)照組,骨小梁間隙高于對(duì)照組(P<0.0

4、5)。
　　2.TMJ髁突軟骨誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究:
　　首先,將GFP-BMSCs分為三組,兩個(gè)共培養(yǎng)組和一個(gè)單獨(dú)培養(yǎng)組。共培養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)組(OATMJ)和對(duì)照組(TMJ)髁突軟骨組織塊放在膜孔8μm的transwell小室上層,GFP-BMSCs接種在小室的下層,分別于共培養(yǎng)后3、7、14、21d收集下室GFP-BMSCs。單獨(dú)培養(yǎng)組的GFP-BMSCs于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行收集。用Trizol法提取兩個(gè)共培養(yǎng)

5、組GFP-BMSCs和單獨(dú)培養(yǎng)組GFP-BMSCs總RNA,采用RealTimePCR定量分析COLII基因的含量。其次,分別取兩個(gè)共培養(yǎng)組以及單獨(dú)培養(yǎng)組的GFP-BMSCs、原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片,行甲苯胺藍(lán)和免疫熒光化學(xué)染色。結(jié)果顯示,與髁突軟骨共培養(yǎng)的GFP-BMSCs表達(dá)COLII,明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)的GFP-BMSCs(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組沒有明顯差異(P>0.05)。
　　3.TMJ髁突軟骨誘導(dǎo)GFP-BMS

6、Cs定向遷移的離體實(shí)驗(yàn)研究:
　　采用膜孔徑8μm的transwell小室鑒定GFP-BMSCs的遷移,取造模3w的實(shí)驗(yàn)組和同齡對(duì)照組髁突軟骨組織塊放在小室的下層,上層接種GFP標(biāo)記BMSCs,24h后,對(duì)小室上層進(jìn)行DAPI染色,觀察從上層上面遷移到上層下面的細(xì)胞數(shù);7d,行甲苯胺藍(lán)染色;21d后,將transwell下室的TMJ進(jìn)行常規(guī)包埋,行HE、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)染色。24h,DAPY染色顯示,實(shí)驗(yàn)組遷移的細(xì)胞數(shù)量

7、多于對(duì)照組(P<0.05);7d甲苯胺藍(lán)染色顯示,無論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組,髁突軟骨以及髁突軟骨附近的GFP-BMSCs均呈藍(lán)紫色,而遠(yuǎn)離髁突軟骨GFP-BMSCs不著色;21dHE染色顯示,實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨內(nèi)有大量的異質(zhì)性的細(xì)胞核,對(duì)照組髁突軟骨中未見此現(xiàn)象;GFP免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色均顯示,實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨GFP表達(dá)陽性,而對(duì)照組髁突軟骨未見表達(dá)GFP表達(dá)。
　　4.外源性BMSCs注射于TMJ區(qū)域后生物發(fā)光技術(shù)示蹤觀察:

8、
　　采用熒光素酶慢病毒轉(zhuǎn)染GFP-BMSCs,獲得持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的LUC-BMSCs。在造模3w的小鼠右側(cè)TMJ區(qū)域,注射LUC-BMSCs(1x108/ml)25μl,左側(cè)注射等量的生理鹽水,在成像系統(tǒng)下縱向動(dòng)態(tài)觀察28d內(nèi)信號(hào)的變化。LUC-BMSCs持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)熒光素梅,且表達(dá)量與細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)。LUC-BMSCs注射小鼠TMJ區(qū)域后,實(shí)驗(yàn)組小鼠顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)域生物發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)度從1.537×106P?s-1?cm

9、-1?sr-1起持續(xù)升高,到7d時(shí)達(dá)到峰值(3.997×106P?s-1?cm-1?sr-1)之后逐漸降低,到28d時(shí)信號(hào)強(qiáng)度降低到1.797×104P?s-1?cm-1?sr-1。
　　5.TMJ局部注射外源性BMSCs治療TMJOA的組織學(xué)評(píng)價(jià):
　　取6周齡C57BL6小鼠60只,隨機(jī)、等量分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。造模3w后,每周在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠右側(cè)顳頜關(guān)節(jié)區(qū)域注射濃度為1x108/ml的GFP-BMSCs25μ

10、l,左側(cè)注射鹽水25μl。分別在注射GFP-BMSCs后4w、8w、12w處死,取出雙側(cè)髁突,多聚甲醛固定,石蠟包埋,行HE、免疫組織化學(xué)染色。HE染色結(jié)果顯示,相同時(shí)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組注射GFP-BMSCs髁突軟骨厚度明顯高比注射生理鹽水側(cè)的髁突軟骨厚度(P<0.05);12w,實(shí)驗(yàn)組注射GFP-BMSCs側(cè)髁突軟骨厚度與對(duì)照組髁突軟骨無明顯差異(P>0.05);免疫組化染色顯示實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨內(nèi)有GFP陽性表達(dá),而對(duì)照組髁突軟骨內(nèi)未見到GFP