DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6——去甲斑蝥素的抗腫瘤作用靶點.pdf

1、研究背景與目的 斑蝥素是中藥斑蝥的提取物，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，表現(xiàn)出抗腫瘤活性。但因其毒性較大，主要為泌尿和消化系統(tǒng)刺激癥狀，限制了其廣泛應(yīng)用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的去甲衍生物，其毒性大大減弱，而抗腫瘤活性與斑蝥素相似，目前被用于治療肝臟腫瘤，慢性肝炎，以及白血病。但其具體作用機制還不清楚。NCTD可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這些腫瘤細(xì)胞包括K562，MCF，HeLa，T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)

2、胞株6T-CEM，以及肝癌細(xì)胞株BEL-7402等；既往的研究發(fā)現(xiàn)，NCTD可以抑制腫瘤細(xì)胞的DNA的復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長；近來研究證實NCTD可以抑制PP2A的活性，重新引起了人們對斑蝥素及其衍生物尤其是NCTD的關(guān)注。但是目前對于NCTD抗腫瘤作用的研究大多只是停留在現(xiàn)象的觀察，對于其作用的分子機理研究不多，NCTD作用的確切靶點尚有待探討。 在真核細(xì)胞中，DNA的復(fù)制受到精確的調(diào)控，一旦起始DNA復(fù)制，必須保證所有

3、的DNA都被復(fù)制，而且在一次細(xì)胞周期中只復(fù)制一次。復(fù)制前復(fù)合體(prereplicationcomplex，Pre-RC)的形成和解體，在調(diào)控DNA的精確復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。DNA的復(fù)制需要在起始位點(Origin)組裝形成Pre-RC，包括：ORC、Cdc6、Cdt1和MCM2-7，這些蛋白相繼組裝在Origin上一起構(gòu)成pre-RC，pre-RC組裝完成后，Origin便具備了起始DNA轉(zhuǎn)錄的能力。其中Cdc6蛋白對于完成pre

4、-RC的組裝至關(guān)重要，抑制Cdc6會阻礙DNA的合成；而過表達(dá)Cdc6會導(dǎo)致在一個細(xì)胞分裂周期內(nèi)出現(xiàn)重復(fù)的DNA復(fù)制。但是Origin具備了起始轉(zhuǎn)錄的能力并不等于立即就可以開始轉(zhuǎn)錄，Origin的激活是以完成pre-RC到pre-IC組裝的過渡為標(biāo)志的，Cdc45被招募組裝到Origin是完成pre-IC的標(biāo)志，Cdc45對于激活起始DNA的復(fù)制具有至關(guān)重要的作用，Cdc45可作為一個橋梁，連接pre-RC與其他DNA復(fù)制所需要的蛋白。

5、 一些實驗證實在一些腫瘤細(xì)胞中Cdc6、Cdc45的表達(dá)比正常細(xì)胞偏高，這些蛋白因子對于腫瘤細(xì)胞的惡性增殖具有重要作用。最近有人提出Cdc6的異常表達(dá)具有癌基因的功能，可直接抑制INK4/ARF基因座位(編碼抑癌基因p15INK4b，p16INK4a和ARF)促進細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。DNA復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白，尤其是Cdc6與腫瘤的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。因其在DNA復(fù)制調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用及腫瘤組織中的特異性增高，抑制其功能有可能在殺傷腫瘤

6、細(xì)胞的同時而對正常細(xì)胞影響較小，Cdc6有可能成為一個有效的、特異性強的抗癌靶點。 本研究的目的是：明確NCTD對DNA復(fù)制起始蛋白的影響，進一步闡明NCTD的抗腫瘤作用機理；明確DNA復(fù)制起始蛋白作為靶點在腫瘤治療中的意義。 方法及結(jié)果 (1)NCTD對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用方法：采用MTT方法檢測NCTD對HL-60、KB、Ramos、Jurkat、Lovo、CNE2、HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。

7、結(jié)果顯示：NCTD對以上幾種腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用，顯示出良好的抗腫瘤活性。對不同腫瘤細(xì)胞抑制作用強度有所差別，以對HL-60抑制作用較強.。IC50分別為：HL-60細(xì)胞42.46±0.49μM、Jurkat細(xì)胞62.46±0.63μM、HepG2細(xì)胞65.82±2.39μM、KB細(xì)胞74.09±1.45μM、Ramos細(xì)胞69.83±7.91μM、Lovo細(xì)胞130.4±21.8μM、CNE2細(xì)胞133.5±6.62μM。

8、 (2)NCTD對HL-60細(xì)胞DNA復(fù)制的抑制作用方法：采用3H-TdR摻入抑制實驗檢測了NCTD對HL-60細(xì)胞DNA復(fù)制的影響。 結(jié)果顯示：不同濃度的NCTD(0-128μM)作用于HL-60細(xì)胞12h后，其3H-TdR摻入量明顯降低。未加藥處理組c.p.m.值為13402±194.21；加藥組的c.p.m.值隨加藥濃度的升高逐漸下降，最高藥物濃度(128μM)下c.p.m.值為2643±362.97。 (3)NC

9、TD對腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制起始蛋白表達(dá)的影響方法：采用WesternBlot方法檢測了NCTD(0-100μM)作用后DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6和Cdc45蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果表明：NCTD作用后Cdc6蛋白被裂解成49KDa的片斷，裂解效果呈現(xiàn)時間與劑量依賴性。隨著NCTD劑量的增加對Cdc6的裂解作用越明顯；且隨著作用時間的延長，Cdc6包括49KDa的片斷，被完全降解。通過分離提取細(xì)胞染色質(zhì)組分蛋白發(fā)現(xiàn)，與染色質(zhì)結(jié)合的Cd

10、c6也被裂解。NCTD對Cdc45蛋白水平及染色質(zhì)定位不產(chǎn)生影響。 (4)NCTD誘導(dǎo)的Cdc6裂解作用中泛素依賴的蛋白酶體或Caspase-3機制的參與？ 方法：我們分別應(yīng)用了泛素依賴蛋白酶體的特異性抑制劑MG132和Caspase-3的特異性抑制劑Ac-DEVD-cho，觀察其對NCTD誘導(dǎo)的Cdc6裂解的影響。 結(jié)果：泛素依賴的蛋白酶體抑制劑MG132(10μM)不能抑制NCTD誘導(dǎo)的Cdc6的裂解，相反與

11、NCTD單獨作用相比，MG132與NCTD聯(lián)合可導(dǎo)致更明顯的Cdc6的裂解，而且MG132單獨作用也可誘導(dǎo)Cdc6的裂解。在NCTD前2h加入Caspase-3特異性抑制劑Ac-DEVD-cho可以抑制NCTD誘導(dǎo)的Cdc6的裂解，Ac-DEVD-cho單獨作用對Cdc6沒有影響。 另外，采用Caspase-3酶活性檢測試劑盒檢測了NCTD作用后HL-60細(xì)胞Caspase-3活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCTD作用Caspase-3酶

12、活性明顯增強。 (5)NCTD對HL-60細(xì)胞周期阻滯及凋亡的影響 方法：采用Hoechst33258染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測了NCTD作用后HL-60細(xì)胞凋亡特征的出現(xiàn)。WesternBlot檢測了Bcl-2、Cdc25C、Cdk1和CyclinB1蛋白表達(dá)的影響。 Hoechst33258染色結(jié)果：對照組細(xì)胞核形態(tài)完整、染色均勻，50μMNCTD處理HL-60細(xì)胞12h后，細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮

13、、顆?；⒂械蛲鲂◇w出現(xiàn)。 DNA瓊脂糖電泳結(jié)果：顯示有DNA梯狀條帶出現(xiàn)。 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：50μM的NCTD可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞逐漸阻滯于G2/M期，至24h到達(dá)高峰，并且隨著NCTD作用時間的延長，亞G1期細(xì)胞比例逐漸升高，至48h到達(dá)高峰(43.8％)。 WesternBlot結(jié)果：NCTD可下調(diào)Cdc25C、Cdk1和CyclinB1蛋白水平；Bcl-2蛋白表達(dá)不受影響。 (6)抑制Cdc6

14、對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用方法：構(gòu)建靶向于cdc6的RNAi質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞周期分析及DNA瓊脂糖電泳檢測細(xì)胞的凋亡變化，MTT法檢測細(xì)胞活力。 結(jié)果：構(gòu)建的RNAi質(zhì)粒pENTR-cdc6轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞后，可有效的沉默cdc6基因，使cdc6的mRNA和蛋白水平下調(diào)。沉默cdc6后，細(xì)胞周期結(jié)果顯示細(xì)胞出現(xiàn)亞G1期阻滯(21.2％)，DNA瓊脂糖電泳顯示有DNA梯狀帶出現(xiàn)。沉默cdc6使HL-60細(xì)

15、胞增殖受到抑制(P＜0.05)，與NCTD聯(lián)合作用比NCTD單獨作用抑制效果更強(P=0.024)。 結(jié)論 (1)NCTD可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞Cdc6蛋白裂解，產(chǎn)生一約49KDa的小片斷；與染色質(zhì)結(jié)合的Cdc6也被裂解，從而阻礙pre-RC的形成，從起始階段抑制DNA的復(fù)制。 (2)NCTD誘導(dǎo)的Cdc6的裂解依賴于Caspase-3的活性，同時NCTD可激活Caspase-3并誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。 (3)