腸易激綜合征神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)失控分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的 腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種常見(jiàn)的消化道功能性疾病，其病理生理機(jī)制始終未被完全闡明。應(yīng)用以往提出的腸道運(yùn)動(dòng)異常機(jī)制、內(nèi)臟感覺(jué)過(guò)敏機(jī)制、腦腸作用機(jī)制、免疫機(jī)制等均難以全面解釋IBS的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)對(duì)于IBS發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入到分子水平，認(rèn)為IBS的發(fā)生可能具有其分子異常的改變。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)腸道具有“自己”的神經(jīng)系統(tǒng)(Entericnervous syst

2、em，ENS)、又有機(jī)體最大的免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，目前認(rèn)為腸道的神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的整體，近來(lái)有人提出IBS“可塑性”發(fā)病機(jī)制的概念，而網(wǎng)絡(luò)調(diào)控即可能是“可塑性”調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)，IBS很可能是這個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失常所引起，而胃腸激素、免疫細(xì)胞因子、細(xì)胞受體、離子通道、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等可能作為這個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的中間介質(zhì)或不同“環(huán)節(jié)”，在IBS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用，并且認(rèn)為這些生

3、物活性物質(zhì)或受體可能是IBS發(fā)病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。那么，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中什么分子是關(guān)鍵分子，如何進(jìn)行分子調(diào)控將是很有興趣的問(wèn)題，可能是今后研究IBS發(fā)病機(jī)制的重要內(nèi)容。為了驗(yàn)證這一新的概念，本研究針對(duì)幾個(gè)難以解釋的IBS臨床常見(jiàn)現(xiàn)象以及尚不明確的IBS發(fā)生機(jī)制，檢測(cè)此網(wǎng)絡(luò)中的幾個(gè)重要分子，以探討其在IBS發(fā)生中的作用。 材料和方法 1．32例女性腹瀉型IBS患者(diarrhea predominant：IBS，d-IB

4、S)和21例女性健康對(duì)照者參與本研究。首先于空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)方法測(cè)定受試者去除血小板的血漿中5-HT/5-HIAA(5-hydroxyindole aceticacid)濃度；其次，測(cè)定受試者飲220ml 37℃溫水及飲同樣體積4℃冷水后30，60，90，120，150，180分鐘的血漿5-HT/5-HIAA濃度。同時(shí)問(wèn)卷調(diào)查所有受試者腹痛/腹部不適、腹脹、腹瀉等癥狀的發(fā)生情況，并對(duì)其嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。

5、 2．根據(jù)羅馬Ⅱ診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇50例腹瀉型IBS患者作為研究組，健康志愿者20例作為對(duì)照組。按既往有無(wú)進(jìn)冷食冷飲后癥狀出現(xiàn)或加重的病史，將腹瀉型IBS患者分為有對(duì)冷刺激敏感史及無(wú)對(duì)冷刺激敏感史兩組；所有受試者行胃鏡檢查，鏡下鉗取胃竇黏膜-70℃保存?zhèn)溆?；?yīng)用5-HT單克隆抗體標(biāo)記EC細(xì)胞，應(yīng)用ANKTMl單克隆抗體標(biāo)記冷敏感溫度受體，免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)EC細(xì)胞和．ANKTMl在腹瀉型IBS患者和健康對(duì)照者胃黏膜的表達(dá)及分布情況。應(yīng)用

6、熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)胃黏膜TRPM8、ANKTMl的mRNA表達(dá)； 3．根據(jù)功能性胃腸病的羅馬Ⅱ診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取IBS患者37例，F(xiàn)D(functionaldyspepsia)患者28例，其均為山東大學(xué)齊魯醫(yī)院消化科門(mén)診病人，同時(shí)征募健康志愿者20例加入本研究。采集空腹靜脈血，用ELISA方法定量測(cè)定受試者血清中牛肉、雞肉、鱈魚(yú)、玉米、螃蟹、雞蛋、蘑菇、牛奶、豬肉、大米、蝦、大豆、西紅柿和小麥等14種食物抗原特異性Ig

7、G抗體水平以及血清總IgE水平，定性測(cè)定受試者血清中上述食物抗原特異性IgE抗體水平。另外，對(duì)所有入選患者進(jìn)行了問(wèn)卷調(diào)查及癥狀評(píng)分。評(píng)價(jià)IBS和FD患者癥狀輕重與升高的食物抗原特異性IgG抗體水平之間的相關(guān)性。 4．應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)奶脂球表皮生長(zhǎng)因子8(milk fat globule-EGFfactor 8，MFG-E8)在腸黏膜巨噬細(xì)胞的表達(dá)；其次，應(yīng)用一個(gè)經(jīng)典的體外腸上皮細(xì)胞(IEC-18)損傷與修復(fù)模型，探討MF

8、G-E8對(duì)IEC-18細(xì)胞移行及損傷修復(fù)的影響及其作用機(jī)制：利用腸黏膜炎癥損傷的動(dòng)物模型進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，探討MFG-E8蛋白在腸黏膜表達(dá)水平的改變及其對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖、移行以及損傷修復(fù)的影響；分別應(yīng)用重組MFG-E8蛋白以及MFG-E8單克隆抗體干預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠，觀(guān)察腸上皮細(xì)胞的增殖、移行以及損傷修復(fù)的改變。 結(jié)果 1．空腹?fàn)顟B(tài)下，腹瀉型IBS患者和健康對(duì)照者的血漿5-HT/5-HI從無(wú)顯著性差異；飲冰水后30，60，90，1

9、20，150分鐘IBS患者血漿5-HT/5-HIAA濃度顯著升高，5-HT代謝率(5-HIAA：5-HT)無(wú)明顯變化，5-HT及5-HIAA峰值以及曲線(xiàn)下面積亦明顯升高。飲溫水未能引起上述結(jié)果。另外，飲冰水后19例IBS患者出現(xiàn)腹痛/腹部不適、腹脹、排便急迫感和/或腹瀉等癥狀，有癥狀的IBS患者的血漿5-HT濃度較未發(fā)生癥狀的患者明顯升高，且其5-HT濃度與癥狀輕重呈正相關(guān)。 2．研究發(fā)現(xiàn)，d-IBS患者胃黏膜5-HT陽(yáng)性細(xì)胞

10、數(shù)目以及ANKTM1表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高，既往有冷食、冷飲不耐受病史(冷食+)的d-IBS患者胃黏膜5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目以及ANKTM1表達(dá)較無(wú)此病史IBS患者(冷食一)明顯增多；在腹瀉型IBS患者和對(duì)照者胃黏膜標(biāo)本中均檢測(cè)到了冷敏感溫度受體TRPM8、ANKTM1的mRNA表達(dá)，熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在不同個(gè)體存在差異；對(duì)冷食、冷飲敏感的IBS患者胃黏膜冷敏感溫度受體ANKTM1表達(dá)較無(wú)冷食、冷飲敏感史的IBS患者

11、以及健康對(duì)照者明顯增高；冷敏感溫度受體TRPM8基因表達(dá)有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3．與健康對(duì)照組相比，IBS患者血清中螃蟹(p=0.000)、雞蛋(p=0.000)、蝦(p=0.000)、大豆(p=0.017)和小麥(p=0.004)抗原特異性IgG明顯升高，F(xiàn)D患者的血清雞蛋(p=0.000)和大豆(p=0.017)抗原特異性IgG顯著升高。與FD患者相比，IBS患者血清中螃蟹、雞蛋、蝦和小麥抗原特異性IgG顯著升高。食

12、物抗原特異性IgE陽(yáng)性率在IBS、FD和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(p=0．971)，血清總IgE抗體滴度在三組受試者之間亦無(wú)顯著差異(p=0．978)。最后，癥狀評(píng)分與血清食物抗原特異性IgG水平的相關(guān)性研究表明，IBS和FD患者癥狀輕重與血清食物抗原特異性IgG水平未見(jiàn)顯著相關(guān)性。 4．免疫熒光染色顯示MFG-E8存在于小腸上皮黏膜固有層巨噬細(xì)胞胞漿中。在體外IEC-18細(xì)胞損傷修復(fù)模型中，MFG-E8干預(yù)顯著促進(jìn)細(xì)胞移行與修復(fù)，

13、并呈劑量依賴(lài)性。PKC抑制劑可阻斷上述作用，提示MFG-E8經(jīng)由PKC信號(hào)通路發(fā)揮作用。MFG-E8促進(jìn)細(xì)胞移行及修復(fù)的機(jī)制在于其可結(jié)合于損傷邊緣移行細(xì)胞膜暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及形態(tài)，使之利于向前移動(dòng)、爬行。在體實(shí)驗(yàn)表明，在腸黏膜炎癥損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，MFG-E8蛋白表達(dá)下降，同時(shí)腸上皮細(xì)胞向腸絨毛頂端移行速度減慢。給與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重組MFG-E8蛋白可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞移行及修復(fù)。而MFG-E8單克隆抗體腹腔注射以及M

14、FG-E8基因敲除可明顯減緩新生腸上皮細(xì)胞向絨毛頂部的移行，因而影響上皮細(xì)胞的更新與修復(fù)。 結(jié)論 1．女性腹瀉型IBS患者進(jìn)食冷食、冷飲后的癥狀加劇與血漿5-HT水平升高有關(guān)。 2．胃黏膜冷敏感溫度受體TRPM8、ANKTMl表達(dá)高低和胃黏膜EC細(xì)胞數(shù)目的多少可能導(dǎo)致IBS患者與健康對(duì)照者對(duì)冷食、冷飲刺激的敏感性的不同。攝入冷食、冷飲對(duì)胃黏膜造成的冷刺激可能通過(guò)激活胃黏膜的冷敏感溫度受體ANKTM1和/或TRPM

15、8，直接或間接導(dǎo)致EC細(xì)胞活化釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而改變腸道的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及分泌并引起癥狀的發(fā)生及加重。 3．本研究中IBS與FD患者顯著升高的血清食物抗原特異性IgG水平提示，食物引起的過(guò)敏反應(yīng)與IgG而非IgE升高有關(guān)，這種IgG介導(dǎo)的胃腸道對(duì)某些食物的過(guò)敏反應(yīng)可能為某些功能性胃腸病潛在的發(fā)病機(jī)制之一。因此，飲食中避免特殊過(guò)敏食物、研發(fā)低抗原性食物以及免疫調(diào)節(jié)治療可能會(huì)成為上述功能性胃腸病的未來(lái)治療手段之一。 4．研究提示

16、，MFG-E8是腸上皮巨噬細(xì)胞分泌的一種與腸黏膜損傷修復(fù)緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)。MFG-E8水平降低可能為某些胃腸黏膜炎性損傷疾病潛在的發(fā)病機(jī)制之一，而且本研究中重組MFG-E8蛋白所顯示的促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)的作用，為上述疾病提供了新的治療策略。 意義 本研究從腸道的神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)切入，探討此網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中關(guān)鍵分子如胃腸激素、免疫細(xì)胞因子、細(xì)胞受體、離子通道、5-HT等與IBS發(fā)病的關(guān)系，尋找IBS發(fā)病的物質(zhì)基礎(chǔ)，從分子水