口腔粘膜干細(xì)胞的生物學(xué)性狀及參與創(chuàng)傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來的研究發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)及創(chuàng)傷修復(fù)中具有重要作用，并已顯示出良好的治療前景。目前對(duì)口腔粘膜上皮干細(xì)胞的研究已經(jīng)開展，但對(duì)其生物學(xué)特性研究尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)；而對(duì)口腔粘膜固有層細(xì)胞的研究比較少見，尤其是口腔粘膜固有層干細(xì)胞的研究更是未見相關(guān)報(bào)道?；诳谇徽衬づc皮膚類似，在維持正常組織結(jié)構(gòu)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，以及皮膚源性上皮干細(xì)胞和真皮組織干細(xì)胞的研究進(jìn)展，因而在口腔粘膜中也應(yīng)含有類似的成體干細(xì)胞。 現(xiàn)代創(chuàng)傷修復(fù)

2、理論認(rèn)為在創(chuàng)傷愈合的過程中，不同的細(xì)胞成分被微環(huán)境激活，參與組織修復(fù)。而且體內(nèi)局部組織特異性的微環(huán)境也決定了干細(xì)胞的可塑性。目前，成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、治療性克隆以及以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程(Tissueengineering，TE)技術(shù)的發(fā)展，為創(chuàng)傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究提供了重要的線索和途徑。但是，在目前研究中合適的種子細(xì)胞應(yīng)用，尤其是自體細(xì)胞的應(yīng)用尚存在如細(xì)胞體外擴(kuò)增能力低及取材困難等難題。 口腔粘膜取材相對(duì)隱蔽，且預(yù)

3、后不留瘢痕，有望成為細(xì)胞移植、基因治療和組織工程中自體成體干細(xì)胞的一個(gè)新來源?？谇徽衬じ杉?xì)胞的研究不僅可進(jìn)一步明確口腔粘膜的生物學(xué)特點(diǎn)，而且由于其自身特點(diǎn)，可以做為種子細(xì)胞，在自體皮膚缺損(尤其是大面積缺損)以及受損角膜等組織的修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。 本研究分離培養(yǎng)口腔粘膜干細(xì)胞，并觀察口腔粘膜干細(xì)胞的生物學(xué)行為；然后應(yīng)用組織工程技術(shù)，構(gòu)建TE膜片，修復(fù)組織缺損，其中包括病損皮膚及眼角膜的修復(fù)觀察。為將來口腔粘膜源性干細(xì)胞在

4、皮膚及眼角膜病損等組織的修復(fù)應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)主要包括以下內(nèi)容： 1、口腔粘膜干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)性狀研究，以兔口腔粘膜為試驗(yàn)對(duì)象，包括口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察，以及口腔粘膜上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察。 (1)口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的檢測(cè)。利用貼壁篩選方法，白兔口腔粘膜固有層中篩選出具有克隆性生長(zhǎng)的細(xì)胞，利用間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)特異表面標(biāo)識(shí)物CD44

5、等加以鑒定，確定所分離細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞；然后采用低密度連續(xù)稀釋法獲得兔口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞克隆，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，明確其生長(zhǎng)曲線；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示：約95.1％細(xì)胞處于G0/G1期；并在成軟骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)，誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞(Ⅱ型膠原)、神經(jīng)細(xì)胞(NSE和S100染色)和脂肪細(xì)胞(脂滴合成和油紅O染色)特異性的標(biāo)志物，提示細(xì)胞具有多向分化潛能，支持篩選的細(xì)胞克隆為成體干細(xì)胞。結(jié)果證

6、明口腔粘膜固有層中含有具有多向分化潛能的固有層間充質(zhì)干細(xì)胞，并能在大量體外擴(kuò)增培養(yǎng)。 (2)口腔粘膜上皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性檢測(cè)。利用上皮干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的快速黏附性，對(duì)口腔粘膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行篩選，同時(shí)利用上皮干細(xì)胞相對(duì)特異標(biāo)識(shí)物β1整合素及Ck19加以鑒定。結(jié)果表明篩選細(xì)胞在體外呈克隆性生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明上皮干細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞所占比例為90.4％；β1整合素及Ck19陽(yáng)性表達(dá)，顯示所篩選細(xì)胞為上皮干細(xì)胞。

7、 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明在口腔粘膜固有層中含有成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，并可在體外大量擴(kuò)增；而口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增。本部分獲得處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)的口腔粘膜干細(xì)胞，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2、口腔粘膜干細(xì)胞應(yīng)用于TE膜片的構(gòu)建，其中包括3部分，分別是TE上皮膜片的構(gòu)建、TE基質(zhì)膜片的構(gòu)建、雙層TE膜片的構(gòu)建。 (1)構(gòu)建TE上皮膜片。用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的組織工程皮膚培養(yǎng)系統(tǒng)，以口腔粘膜上皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞，分

8、別以膠原膜及脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為支架，體外構(gòu)建TE上皮膜片，培養(yǎng)取材，常規(guī)HE染色檢測(cè)，并同時(shí)利用CK10(上皮角化特異標(biāo)識(shí)物)、CK19及β1整合素檢測(cè)。結(jié)果顯示口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在膠原膜及脫細(xì)胞支架上形成無角化的上皮結(jié)構(gòu)，并且底層存在上皮干細(xì)胞。表明口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在體外成功構(gòu)建TE上皮膜片，同時(shí)仍保留一定的上皮干細(xì)胞，可能更有利于損傷部位結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)。 (2)構(gòu)建TE基質(zhì)膜片。首先以固有層間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，

9、與膠原凝膠混合構(gòu)建TE基質(zhì)膜片，同時(shí)以固有層成纖維細(xì)胞為對(duì)照組；HE結(jié)果顯示，10d時(shí)固有層間充質(zhì)干細(xì)胞組在細(xì)胞數(shù)量上比對(duì)照組多，這種數(shù)量上的差異可能在創(chuàng)傷修復(fù)中將起到重要作用。 然后，以固有層間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)膜片上構(gòu)建TE基質(zhì)膜片，同時(shí)以兔角膜基質(zhì)細(xì)胞為對(duì)照。HE染色觀察，并進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果顯示固有層間充質(zhì)干細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)狀態(tài)良好；表明可在體外形成TE基質(zhì)膜片，為口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞在缺損修

10、復(fù)中的應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)條件。 (3)構(gòu)建雙層TE膜片。共分為5組，包括A組：固有層間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞；B組：固有層間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞/上皮細(xì)胞；C組：固有層成纖維細(xì)胞和上皮干細(xì)胞；D組：固有層成纖維細(xì)胞和上皮干細(xì)胞/上皮細(xì)胞；E組：皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚表皮細(xì)胞(對(duì)照組)；以膠原凝膠為支架，構(gòu)建含兩種不同類型細(xì)胞的雙層TE膜片。通過HE染色、免疫組織化學(xué)方法對(duì)TE膜片進(jìn)行檢測(cè)，觀察構(gòu)建的異同。結(jié)果顯示利用上皮干細(xì)胞

11、可形成角化上皮，且仍有大量上皮干細(xì)胞的存在，形成基底層；混合上皮干細(xì)胞/上皮細(xì)胞，構(gòu)建的TE膜片中上皮層明顯多于其它組，且有基底層的形成及上皮干細(xì)胞的存在，可能原因在于混合組的細(xì)胞形成微環(huán)境，更適于上皮干細(xì)胞的分化增殖，同時(shí)也促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖。 本部分結(jié)果表明，兔口腔粘膜干細(xì)胞可以作為種子細(xì)胞，在不同支架材料上可以在體外成功構(gòu)建TE膜片，為將來應(yīng)用于缺損修復(fù)奠定一定的基礎(chǔ)。 3、口腔粘膜干細(xì)胞構(gòu)建TE膜片應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)

12、，在第2部分成功構(gòu)建TE膜片基礎(chǔ)上，選擇三種不同損傷模型(包括全層皮膚缺損、角膜潰瘍以及角膜緣干細(xì)胞缺損)，對(duì)兩種不同組織，包括皮膚(角化)和角膜(無角化)進(jìn)行修復(fù)，探討口腔粘膜上皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，在不同種類的受損上皮組織修復(fù)中的作用；同時(shí)探討口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在不同受損類型中修復(fù)真皮層及基質(zhì)層中的作用。 (1)全層皮膚缺損模型的修復(fù)。以體外構(gòu)建的雙層TE膜片修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損，30d后取材，HE檢測(cè)。

13、結(jié)果證明由兩種口腔粘膜干細(xì)胞所構(gòu)建的TE膜片修復(fù)裸鼠的皮膚缺損，形成的皮膚結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞狀態(tài)良好，可以成功修復(fù)并有大量真皮微血管長(zhǎng)入，具有更好的修復(fù)效果。 (2)兔角膜潰瘍模型的修復(fù)。以熒光染料PKH26標(biāo)記口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞，將其接種在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上，構(gòu)建TE基質(zhì)膜片。術(shù)后進(jìn)行大體及HE染色觀察、熒光顯微鏡觀察。結(jié)果表明TE基質(zhì)膜片移植后，可以修復(fù)角膜潰瘍，熒光觀察結(jié)果表明固有層間充質(zhì)干細(xì)胞8周時(shí)依然存在，說明其參與

14、角膜基質(zhì)的修復(fù)重建，本實(shí)驗(yàn)首次證明口腔粘膜來源的固有層間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)角膜基質(zhì)的損傷。 (3)角膜緣干細(xì)胞缺損的修復(fù)。利用兔口腔粘膜上皮干細(xì)胞以脫細(xì)胞基質(zhì)材料為支架構(gòu)建的TE上皮膜片，進(jìn)行自體角膜干細(xì)胞缺損模型的修復(fù)，術(shù)后進(jìn)行大體及HE染色觀察。結(jié)果表明可以修復(fù)角膜干細(xì)胞缺損，為角膜提供穩(wěn)定的上皮來源，阻止新生血管入侵，恢復(fù)角膜透明性，使眼表健康重建；同時(shí)表明創(chuàng)傷局部微環(huán)境是口腔粘膜上皮干細(xì)胞替代角膜干細(xì)胞，參與角膜組織修復(fù)