虎金顆粒及其含藥血清抗肝纖維化作用機(jī)制研究.pdf

1、我國(guó)是肝病發(fā)病率較高地區(qū)，肝炎病毒攜帶率為總?cè)藬?shù)的10％左右，肝炎病毒感染率則更高，大約為50％。其中，肝硬化(尤其是肝炎肝硬化)在我國(guó)十分常見(jiàn)，嚴(yán)重危害著人民的身心健康。但時(shí)至今日，仍未找到有效的防治辦法。研究顯示，肝硬化大多由各種慢性肝病演變而來(lái)，而各種慢性肝病都有一個(gè)共同的病理學(xué)基礎(chǔ)—肝纖維化。肝纖維化是伴隨肝損傷之后的一種病理修復(fù)反應(yīng)，表現(xiàn)為肝內(nèi)膠原纖維異常增生，肝細(xì)胞變性壞死，肝組織結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，造成肝功能異常，影響肝病

2、預(yù)后，是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。實(shí)際上，肝纖維化可防可治，在演變?yōu)楦斡不?，通過(guò)某種手段阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，在慢性肝病的治療上，將有重大突破。 肝硬化后期可并發(fā)上消化道出血、腹水和肝性腦病，嚴(yán)重危害患者生命。早期肝硬化患者具有可逆轉(zhuǎn)的特點(diǎn)，因此恰當(dāng)及時(shí)的藥物治療以干預(yù)肝纖維化發(fā)展成肝硬化具有重要的意義。 目前治療肝纖維化的藥物仍處在研究階段，傳統(tǒng)抗肝纖維化藥物如秋水仙堿、馬替洛酯等，因療效不確切和副

3、作用大限制了其應(yīng)用，干擾素治療肝纖維化的療效在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中已被證實(shí)，但價(jià)格昂貴。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越注重從傳統(tǒng)藥物中發(fā)掘抗肝纖維化藥物。臨床和基礎(chǔ)研究均表明，一些中藥具有顯著的抗肝纖維化作用，且價(jià)格低廉、副作用小，從而有著廣泛的開發(fā)前景。 中醫(yī)理論認(rèn)為，肝纖維化屬“積證”、“脅痛”等范疇，其病機(jī)不外乎氣滯、血瘀、肝脾功能失調(diào)，其中血瘀乃各種病機(jī)之基礎(chǔ)。其治則總不離活血化瘀、益氣活血、舒肝健脾、軟堅(jiān)消積等。 虎金丸是

4、臨床經(jīng)驗(yàn)方，其中虎杖、郁金活血化瘀，行氣止痛共為君藥；山楂、三七活血化瘀，澤瀉利水滲濕共為臣藥，靈芝益氣補(bǔ)虛為佐使之品。諸藥合用，共奏活血化瘀、益氣行滯之功。本課題研究了虎金顆粒對(duì)二甲基亞硝胺(DMN)致肝纖維化大鼠的治療作用，并深入探討了虎金顆?？垢卫w維化的作用機(jī)制，尤其是對(duì)肝纖維化發(fā)生的主要細(xì)胞因子之一TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Smad蛋白表達(dá)的影響；體外研究采用中藥血清藥理學(xué)方法，探討虎金顆粒含藥血清對(duì)肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)HSC-

5、T6I型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)mRNA及受體TGβRⅡmRNA表達(dá)的影響，以此探討虎金顆?？垢卫w維化的細(xì)胞分子機(jī)制。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半。采用DMN誘導(dǎo)肝纖維化模型，每只大鼠給予0.5％DMN(2ml/kg)腹腔注射，第1周前3天連續(xù)給2/3藥量，后4天不給藥，第2周開始前3天連續(xù)給全藥量，共給藥4周。正常對(duì)照組給予相同量的生理鹽水腹腔注射。造模結(jié)束后，將存活的大鼠隨機(jī)分為6組，分別

6、為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、大黃(蟲庶)蟲丸組、虎金顆粒高劑量(2.4g/kg)組、虎金顆粒中劑量(1.2g/kg)組、虎金顆粒低劑量(0.6g/kg)組。每天給藥1次，連續(xù)灌服4周。給藥結(jié)束后，采血，進(jìn)行肝功能檢測(cè)：ALT、AST、TP、ALB；肝纖維化指標(biāo)測(cè)定：HA、LN、PCⅢ；取肝組織，進(jìn)行MDA、SOD、Hyp測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束10％中性甲醛固定肝組織，切片HE、VG膠原染色，光鏡觀察。采用免疫組化技術(shù)對(duì)大鼠肝組織TGF-β1、Sm

7、ad3、7，α-SMA進(jìn)行檢測(cè)，觀察虎金顆粒對(duì)上述指標(biāo)在肝纖維化大鼠肝組織中表達(dá)的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)量資料，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；計(jì)數(shù)資料則選用epi6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 體外實(shí)驗(yàn)： SPF級(jí)SD雄性大鼠，虎金顆粒按2ml/100g(用藥量相當(dāng)于60kg成人每日每公斤劑量的10倍)，給大鼠灌胃，每天2次，連續(xù)3d，晚間禁食12h，于第4天第1次給予全日劑量1.0h后，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2h，4℃，30

8、00r/min，離心20min，分離血清，56℃滅活30min，過(guò)濾除菌，分裝，-80℃凍存。 HSC-T6培養(yǎng)： HSC-T6復(fù)蘇后常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，以105/ml的濃度接種，每2～3天更換1次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞長(zhǎng)至亞單層。 HSC-T6藥物血清處理及其收集： HSC-T6用10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液4ml接種于25ml培養(yǎng)瓶，48h后施加處理因素后，置于4℃冰箱同步化1h，隨后分組如下：空白對(duì)照組：(D

9、MEM4.0ml)、TGF-β1(10ng/ml)組：(DMEM3.8ml+200ng/ml的TGF-β1200μl)、10％正常大鼠血清組：(DMEM3.4ml+200ng/ml的TGF-β1200μl+空白血清400μl)、5％藥物大鼠血清組：(DMEM3.6ml+200ng/ml的TGF-β1200μl+藥物血清200μl)、10％藥物血清：(DMEM3.4ml+200ng/ml的TGF-β1200μl+藥物血清400μl)、20

10、％藥物血清組：(DMEM3.0ml+200ng/ml的TGF-β1200μl+藥物血清800μl)。以上各組DMEM均含2％的小牛血清。培養(yǎng)24h后，棄上清，加入Trizol1ml/瓶，反復(fù)吹打，收集懸液，立即放入-80℃冰箱。每瓶重復(fù)3次，于末次一并提取RNA。 檢測(cè)指標(biāo)及方法： 按Trizol試劑盒說(shuō)明書一步法提取總RNA，用DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。將抽提的RNA放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用逆轉(zhuǎn)

11、錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)HSC-T6Ⅰ型膠原、TGF-β1和TβRⅡmRNA的表達(dá)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物6ul在1.8％瓊脂糖凝膠上電泳30min(100V)，圖像分析儀采圖，以內(nèi)參為基準(zhǔn)，作半定量分析，即以單位面積的擴(kuò)增目的片段/單位面積的GAPDH的灰度值表示所擴(kuò)增目的基因片段的相對(duì)表達(dá)水平。 研究結(jié)果： 1、動(dòng)物一般狀況：經(jīng)DMN造模后，大鼠死亡率達(dá)25％，大部分存活鼠產(chǎn)生腹水。 2、DMN造模成

12、功后，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST明顯升高，虎金顆粒各劑量組血清ALT、AST含量降低，有一定的劑量依賴關(guān)系，表明虎金顆粒有明顯的保肝降酶作用。模型對(duì)照組大鼠ALB含量下降，經(jīng)虎金顆粒干預(yù)后，可提高血清ALB水平，糾正A/G比例，表明虎金顆粒能夠恢復(fù)大鼠白蛋白水平，具有保肝作用。模型對(duì)照組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量顯著升高，虎金顆粒各劑量組尤其是中高劑量組HA、LN、PCⅢ含量明顯低于模型對(duì)照組。以上結(jié)果均表明，虎金顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性

13、肝纖維化模型具有治療作用，能減輕肝細(xì)胞損傷，改善肝功能，降低肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ的含量，從而減輕肝纖維化程度。 3、模型對(duì)照組大鼠肝組織MDA、Hyp的含量明顯升高，SOD含量下降。經(jīng)虎金顆粒治療后，MDA、Hyp含量均有不同程度下降，SOD含量得到恢復(fù)，表明虎金顆粒能明顯降低肝纖維化大鼠肝臟中異常升高的MDA含量，提高SOD水平，提示其抗肝纖維化機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。 4、病理觀察結(jié)果表明，虎金顆粒

14、不同劑量能減輕肝細(xì)胞壞死，明顯抑制肝組織中成纖維細(xì)胞及膠原纖維增生，肝纖維化大鼠肝組織結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，纖維組織明顯減少。 5、免疫組化結(jié)果表明，模型組大鼠肝內(nèi)TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，Smad3表達(dá)則主要集中在纖維間隔中。同時(shí)，正常大鼠肝細(xì)胞內(nèi)Smad7明顯可見(jiàn)表達(dá)，模型對(duì)照組大鼠肝內(nèi)表達(dá)明顯下降，顯示該蛋白參與維持肝細(xì)胞正常生理功能，肝纖維化時(shí)表達(dá)受抑制，負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1作用減弱。經(jīng)虎金顆粒治療后的

15、肝纖維化大鼠，肝組織結(jié)構(gòu)改善，肝內(nèi)Samd7表達(dá)增加，同時(shí)，TGF-β1和Smad3表達(dá)下調(diào)，表明虎金顆粒對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定的干預(yù)作用。 6、體外研究結(jié)果表明，虎金顆粒藥物血清可明顯下調(diào)HSC-T6細(xì)胞TGF-β1、TβRⅡmRNA的表達(dá)，表明虎金顆粒能抑制細(xì)胞因子TGF-β1合成，以及TGF-β1與受體的結(jié)合，TGF-β1信號(hào)下傳在其受體水平上首先被抑制，TGF-β1不能傳遞到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮促肝纖維化作用?；⒔痤w粒藥物

16、血清能抑制HSC-T6Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)，表明虎金顆粒能干預(yù)膠原合成，具有抗肝纖維化作用?；⒔痤w粒含藥血清對(duì)HSC-T6Ⅰ型膠原、TGF-β1和TβRⅡmRNA的表達(dá)的抑制作用，以10-20％血清作用較為明顯。 綜上，TGF-β1在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，同時(shí)HSC又能表達(dá)TGF-β1，通過(guò)自分泌和旁分泌作用，上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而加速肝纖維化的進(jìn)程?；⒔痤w粒能抑制肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1及其信號(hào)蛋白的表