微小RNA-1通過調(diào)節(jié)基因KCNE1和KCNB2的表達促進快速起搏兔心房電重構的研究.pdf

1、研究背景：
　　心房顫動（房顫AF）是指心房活動不協(xié)調(diào)，導致規(guī)則有序的心房電機械功能惡化，在心電圖上的表現(xiàn)為P波消失，代之以不規(guī)則的基線波動，心室率極不規(guī)則，是最嚴重的心房電活動紊亂之一，具有較高的致病率、致殘率，并導致了沉重的社會經(jīng)濟負擔。無序的顫動使心房泵血功能喪失或惡化，加之房室結對快速無序的心房激動的遞減傳導，可引起心室極不規(guī)則的興奮，心房收縮力喪失，血流瘀滯易形成栓子。因此心功能受損、心室率（律）紊亂、心房附壁血栓形成等

2、是AF患者的主要病理生理特點。過去很多實驗室或臨床研究已經(jīng)表明，心房電重構(ER)和結構重構(SR)是發(fā)生AF的兩大主要機制。心房ER主要包括心房有效不應期（AERP）及動作電位時程的縮短，動作電位傳導速度減慢，是AF或快速心房率所產(chǎn)生的有利于AF維持和發(fā)生的心房電生理特性的改變。ER發(fā)生在AF過程的較早期，而SR發(fā)生的相對較晚。近來對編碼特異離子通道蛋白基因的mRNA表達異常的研究引起了越來越多的關注，它可以引起離子通道蛋白數(shù)量、結構

3、、性質的改變，尤其是鉀離子通道，從而成為ER和心律失常的潛在分子機制。其中轉錄后水平對mRNA的調(diào)節(jié)也成為了人們關注的焦點。目前藥物依然是AF治療的重要方法，藥物能恢復和維持竇性心律，控制心室率。但是藥物治療的副作用較多如惡心、頭暈、疲勞甚至室性心律失常。AF的非藥物治療包括電轉復、射頻消融治療和外科迷宮手術治療。電復律是指用兩個電極片放置在病人胸部的適當部位，通過除顫儀發(fā)放電流，重新恢復竇性心律的方法。電復律不是一種根治AF的方法，A

4、F往往會復發(fā)，而且部分患者仍需要繼續(xù)服用抗心律失常藥物維持竇性心律。導管消融治療及外科迷宮手術都屬于有創(chuàng)治療，易并發(fā)感染及血栓形成等。因此，要找到一個高效、安全的新策略用于治療AF是非常重要的。
　　MicroRNA(miRNA)是小RNA中的一個大家族，最早是Lee等人在線蟲中發(fā)現(xiàn)，其在果蠅、植物和哺乳動物等真核生物中均有所發(fā)現(xiàn)。因為它在動植物體內(nèi)發(fā)揮著重要且廣泛的調(diào)控作用，日漸成為人們新的研究熱點。miRNA為一類內(nèi)源性非編碼

5、的單鏈小RNA，通過與其5'端“種子序列”與目的基因mRNA的3'非翻譯區(qū)完全或不完全性互補配對，對目的基因mRNA的堿基進行切割或抑制翻譯，指導RNA誘導沉默復合體(RISC)來調(diào)節(jié)目的基因表達，介導轉錄后基因調(diào)控。新進的研究表明miRNA不僅調(diào)控發(fā)育，而且在造血、細胞增殖和死亡等方面發(fā)揮作用，另外對心肌肥厚、心力衰竭、動脈粥樣硬化和心律失常等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的影響。
　　MiRNA作為轉錄后調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，可以對

6、編碼特異離子通道蛋白基因的mRNA表達產(chǎn)生影響，進而使離子通道蛋白及連接蛋白過度表達或低表達，致使離子通道平衡失調(diào)，誘發(fā)心律失常。miRNA的表達具有組織特異性，如在心肌富含miR-1，let-7，miR-133，miR-126-3p，miR-30c，而動脈平滑肌富含miR-145，let-7，miR-125b，miR-125a，miR-23和miR-143，但miR-i與miR-133在其中也有表達。miR-1與miR-133被認為是

7、肌肉特異性miRNA，在成人的心臟及骨骼肌中優(yōu)先表達。現(xiàn)在的研究認為miR-1在許多心臟疾病中扮演重要角色，特別是心律失常的病理生理過程。Yang等研究發(fā)現(xiàn):梗死小鼠心臟內(nèi)過量表達miR-1可以導致心律失常。miR-1通過作用于基因GJA1和KCNJ2減少心肌Cx43，Kir2.1蛋白的表達，使減慢傳導，降低了心肌內(nèi)向整流鉀離子電流(IK1)，導致細胞膜去極化，促使發(fā)生快速性心律失常，心電圖中表現(xiàn)為QRS波增寬，QT間期延長。而miR-

8、1通過反義寡核苷酸(AMO-1)被移除后，心律失常的發(fā)生明顯減少。由此可知miR-1通過引起心肌缺血時離子通道失衡而達到其致心律失常作用。近來在Terentyev等人的研究中發(fā)現(xiàn)miR-1還可以通過調(diào)節(jié)鈣離子流來參與心律失常的發(fā)生。因此，miR-1被認為是治療心律失常的新靶點。
　　雖然miR-1在心律失常病理生理過程中的作用已經(jīng)有所研究，但是miR-1在AF早期ER中所發(fā)揮的機制至今還沒有報道。目前miRNA-1在體轉染的研究中

9、大部分選小鼠為動物模型，轉染后將心肌細胞進行體外培養(yǎng)，檢測其對應的離子通道蛋白含量的變化，但在大型動物模型中進行miRNA-1在體轉染的研究較為少見，而大型動物如犬、兔等AF的發(fā)生發(fā)展過程更接近于人類，且在體轉染miRNA對動物模型AF的維持與誘發(fā)等觀察更直接，因此，我們選擇新西蘭大白兔做為AF模型來探討相關miRNA-1的參與機制，有助于我們更好理解人類AF發(fā)生的機制。雖然新西蘭大白兔的miRNA序列還沒有納入miRbase數(shù)據(jù)庫中，

10、但我們在Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/Oryctolagus_cuniculus/Info/Index）中找到新西蘭大白兔的基因序列草圖，可用軟件分析出其miR-1的序列。據(jù)此，本課題組擬以快速心房起搏兔為研究模型，以miR-1為候選miRNA，活體心房內(nèi)注射轉染miR-1及AMO-1，檢測miR-1在快速心房起搏兔模型心房肌中的表達及鉀離子通道蛋白含量及其編碼mRNA的變化，以闡明miR-1參與

11、AF的發(fā)展與維持，為AF的治療提供新的靶點。
　　研究目的：
　　1.評價miR-1在快速起搏1周后在兔心房肌中表達水平的變化;
　　2.明確miR-1的異常表達與快速起搏兔心房早期ER的關系;
　　3.探究miR-1促進心房早期ER的潛在分子機制。
　　材料和方法：
　　1.動物模型建立
　　1.1、動物分組
　　選購健康新西蘭大白兔24只，雌雄不拘，體重1.5-2.5kg，隨機分為4組

12、，各組6只。其中第1組設為假手術，第2組設為快速起搏組，第3組設為起搏+miRNA-1轉染組，第4組設為起搏+AMO-1轉染組。
　?、偌偈中g（第1組，n=6），埋置起搏器不予起搏，1周后開胸，右房(RA)心肌內(nèi)注射對照病毒，1周后處死;
　　②心房快速起搏組（第2組，n=6），埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開胸，RA心肌內(nèi)注射對照病毒，1周后處死;
　?、坌姆靠焖倨鸩?miR-1轉染組（第3組，n=6

13、），埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開胸，RA心肌內(nèi)注射miR-1，1周后處死;
　?、苄姆靠焖倨鸩?miR-1轉染組（第4組，n=6），埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開胸，RA心肌內(nèi)注射AMO-1，1周后處死。
　　1.2、快速心房起搏模型建立
　　先用3％戊（苯）巴比妥鈉(30-35mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈將新西蘭大白兔麻醉，繼以氟烷(2-3％)及一氧化二氮(60-75％)維持麻醉狀態(tài)(

14、28)，仰臥位固定動物，氣管插管，呼吸機機械通氣，調(diào)節(jié)呼吸頻率30-50bpm，每分通氣量15-40ml，吸呼比為2∶1。胸頸部用利多卡因局麻并脫毛、常規(guī)消毒、鋪巾，切開右頸部皮膚、分離皮下組織，暴露右頸內(nèi)靜脈，送入“J”形心房單電極，在X線透視下將電極頭端固定于右心耳，整個過程都遵守無菌操作。
　　2.電生理指標檢測
　　電生理檢查通過多通道程序刺激儀分別于起搏前、轉染前、轉染1周三個時間點進行，并由電生理記錄系統(tǒng)記錄下R

15、A心內(nèi)心電圖。AERP的測定采用S1S2反向掃描刺激法，S1S2呈8∶1，步長5ms，基礎起搏刺激周長分別為150、130ms，AERP定義為S2不引起心房激動的最長S1S2間期。AF由S1S2程序刺激或者burst刺激誘發(fā)。
　　3.構建和生產(chǎn)慢病毒
　　新西蘭大白兔miR-1和AMO-1的前體序列由TELEBIO公司構建，慢病毒滴度為1×109TU/ml。
　　4.在體基因轉染
　　在快速起搏1周后，右胸第4

16、肋間打開胸腔，充分暴露心臟并剝離心包，將慢病毒復合物多點斜行注射到快速心房起搏兔RA前壁，關胸。一周后處死，立即取出心臟用PBS液由主動脈根部逆行灌注，然后分離出RA，拭干后保存在-80℃有待下一步使用。
　　5.實時定量RT-PCR
　　實時熒光定量RT-PCR反應檢測miR-1和KCNE1/KCNB2mRNA表達水平。
　　6.Western blot檢測
　　Western blot檢測KCNE1和KCNB

17、2所編碼的離子通道蛋白表達水平。
　　7.熒光素梅報告分析
　　通過熒光素梅報告分析證實KCNE1和KCNB2是miR-1的靶基因。
　　結果：
　　1.在快速起搏1周后，兔RA可發(fā)現(xiàn)早期ER;
　　2.在快速起搏1周后，miR-1的表達水平發(fā)生上調(diào);
　　3.通過轉染外源基因使miR-1過表達，促進了心房ER的發(fā)生，應用AMO-1拮抗miR-1后可逆轉上述現(xiàn)象;
　　4.KCNE1和KCNB2

18、是miR-1的靶基因，他們的表達水平呈負相關。
　　結論：
　　MiR-1通過作用于其靶基因KCNE1和KCNB2來調(diào)節(jié)后者編碼的鉀離子通道蛋白，從而影響心臟鉀離子通道及電流，參與了由快速起搏引起的早期心房ER，表明miR-1可能在AF的發(fā)生過程中起到重要的作用。因此，miR-1作為治療AF的潛在靶點具有重要的臨床意義。
　　創(chuàng)新性：
　　1.用新西蘭大白兔制作快速心房起搏動物模型并檢測miR-1在心房細胞中的表

19、達變化;
　　2.心房肌內(nèi)活體注射miR-1及AMO-11周后體外檢測離子通道蛋白及其編碼基因的變化，探討miR-1對鉀離子通道及心房ER的影響及意義。
　　局限性：
　　1.迄今為止，已有數(shù)千個microRNA分子先后在生物體內(nèi)被鑒定，我們只進行了miR-1對心房早期ER的研究。
　　2.同一種miRNA在不同的AF類型或在AF的不同時期發(fā)揮作用的不盡相同，我們只研究了miR-1對快速起搏兔右心房早期ER的影響