長非編碼RNA通過調(diào)節(jié)BACE1表達(dá)介導(dǎo)β淀粉樣蛋白生成的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與研究目的：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又稱老年性癡呆，是發(fā)生于老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，是一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年期癡呆的最常見類型。臨床上表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算力損害、人格和行為的改變等。阿爾茨海默病國際(Alzheimer’s Disease Internation

2、al，ADI)發(fā)布年度報(bào)告顯示，2010年全世界約有癡呆患者3560萬例，2030年將達(dá)到6570萬例，2050年將達(dá)1.1540億例，其中約50-75％為AD患者。2010年全球因癡呆帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)約為6040億美元，約為全球GDP總量的1％。迄今為止，對(duì)于AD尚無特效治療方法。究其原因，主要是我們對(duì)AD的病因和發(fā)病機(jī)制的尚不明了。因此，進(jìn)一步深入研究AD的病因和發(fā)病機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探索防治AD的新方法仍是目前亟需解決的重大問題。<

3、br>　　 AD組織病理學(xué)上的兩個(gè)經(jīng)典的改變?yōu)樯窠?jīng)炎性斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說在AD的發(fā)病機(jī)制研究中一直占有核心地位，認(rèn)為Aβ的沉積導(dǎo)致了腦內(nèi)神經(jīng)元的功能異常和死亡。β分泌酶又稱β位點(diǎn)APP裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme1，BACE1)，是一種膜結(jié)合的天冬氨酸蛋白酶，是裂解APP產(chǎn)生Aβ的限速酶。
　　 非編碼NRA(noncoding RNA，ncRNA)是指不能翻譯為蛋白質(zhì)

4、，但具有生物學(xué)功能的RNA。長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指長度超過400個(gè)核苷酸的非編碼RNA，包括長基因間非編碼RNA(long intergenic noncoding RNA，lincRNA)、自然反義轉(zhuǎn)錄物(natural antisense transcript，NAT)和重復(fù)非編碼RNA(non-coding RNA repeats)等。BACE1反義轉(zhuǎn)錄物(BACE1 antise

5、nse transcript，BACE1-AS)是一種保守的長約2kb的lncRNA，由定位于11號(hào)染色體上的BACE1基因位點(diǎn)(11q23.3)對(duì)側(cè)鏈轉(zhuǎn)錄生成。
　　 在AD患者額葉皮層、海馬和內(nèi)嗅皮層等部位均可見BACE1-AS含量的明顯升高和BACE1 mRNA含量的輕度升高，提示BACE1-AS可能參與了AD的發(fā)病機(jī)制。已有研究表明，BACE1-AS對(duì)BACE1 mRNA的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可以與BACE1mRNA

6、結(jié)合，增加后者的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)Aβ的生成；并且Aβ1-42在體外可以促進(jìn)BACE1-AS表達(dá)的上調(diào)，實(shí)現(xiàn)Aβ生成的正反饋激活機(jī)制。那么，Aβ1-42在體內(nèi)是否同樣具有激活BACE1-AS，增加BACE1 mRNA含量，并促進(jìn)Aβ生成的作用?在APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)，BACE1-AS是否參與了BACE1表達(dá)和Aβ生成調(diào)節(jié)機(jī)制?Aβ1-42激活BACE1-AS表達(dá)上調(diào)的機(jī)制是什么呢?
　　 依據(jù)上述背景，本研究首先在體內(nèi)觀察了外源

7、性Aβ1-42對(duì)C57/BL6J小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1表達(dá)和Aβ生成的影響；在體外采用AD細(xì)胞模型觀察了APPsw基因轉(zhuǎn)入對(duì)BACE1-AS、BACE1表達(dá)和Aβ生成的影響，以及siRNA干擾抑制BACE1-AS的表達(dá)對(duì)Aβ生成的影響；在體內(nèi)、體外分別觀察了NF-κB對(duì)Aβ1-42促進(jìn)BACE1-AS表達(dá)上調(diào)和Aβ生成的介導(dǎo)作用機(jī)制。
　　 研究內(nèi)容：
　　 1.BACE1-AS介導(dǎo)外源性Aβ1-42對(duì)細(xì)胞

8、和動(dòng)物BACE1表達(dá)和Aβ生成的促進(jìn)作用機(jī)制。
　　 2.BACE1-AS參與APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BACE1表達(dá)和Aβ生成的作用機(jī)制。
　　 3.NF-κB調(diào)節(jié)BACE1-AS表達(dá)和Aβ生成的作用機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.為了明確Aβ1-42在體內(nèi)是否同樣具有激活BACE1-AS，增加BACE1 mRNA含量，并促進(jìn)Aβ生成的作用，首先在部分重復(fù)外源性Aβ1-42在體外對(duì)BACE1-AS表達(dá)激活

9、作用的基礎(chǔ)上，采用BACE1-AS的siRNA干擾BACE1-AS的表達(dá)，觀察其對(duì)BACE1mRNA和BACE1蛋白表達(dá)，以及對(duì)Aβ1-40生成的影響；然后采用立體定向技術(shù)將外源性Aβ1-42直接注入C57/BL6J小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)，觀察小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1mRNA的表達(dá)水平和Aβ1-40的含量。
　　 2.為了明確BACE1-AS是否參與了APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)BACEl表達(dá)和Aβ生成的作用機(jī)制，首先采用將APP

10、sw基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞所得的細(xì)胞株20E2作為研究對(duì)象，觀察APPsw基因轉(zhuǎn)入對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的BACE1-AS、BACE1 mRNA表達(dá)及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影響；然后采用RNA干擾技術(shù)抑制BACE1-AS的表達(dá)，觀察其對(duì)BACE1 mRNA和BACE1蛋白表達(dá)的影響，以及對(duì)Aβ1-40和Aβ1-42含量的影響。
　　 3.為了明確NF-κB是否參與了對(duì)BACE1-AS表達(dá)的調(diào)控，首先檢測了Aβ1-42立

11、體定向注射入海馬后NF-κB的表達(dá)情況，Aβ干預(yù)對(duì)體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞NF-κB的表達(dá)情況，以及APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)情況；然后，在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞加入Aβ1-42處理之前給予NF-κB的抑制劑celastrol處理，采用NF-κB的抑制劑celastrol干預(yù)APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞20E2，分別觀察對(duì)BACE1-AS、BACE1mRNA表達(dá)，BACE1蛋白含量，以及對(duì)Aβ生成的影響。
　　 研

12、究結(jié)果：
　　 1.BACE1-AS介導(dǎo)外源性Aβ1-42對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物BACE1表達(dá)和Aβ生成的促進(jìn)作用機(jī)制。
　　 1.1外源性Aβ1-42在體外促進(jìn)了SH-SY5Y細(xì)胞BACE1-AS、BACE1的表達(dá)和Aβ的生成。1μM的Aβ1-42作用于體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞后2hr可見BACE1-AS、BACE1 mRNA、以及BACE1蛋白的表達(dá)明顯升高，干預(yù)后24hr細(xì)胞外液的Aβ1-40的含量明顯升高。上述結(jié)果與F

13、aghihi MA等的報(bào)道結(jié)果一致。BACE1-AS的siRNA預(yù)處理明顯抑制了Aβ1-42對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞BACE1-AS、BACE1的表達(dá)和Aβ生成的促進(jìn)作用。加入siRNA預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)BACE1-AS、BACE1 mRNA的含量均明顯降低，細(xì)胞內(nèi)BACE1蛋白表達(dá)明顯減低，細(xì)胞外液Aβ1-40的濃度明顯下降。這說明抑制BACE1-AS的表達(dá)可以抑制外源性Aβ1-42對(duì)細(xì)胞BACE1表達(dá)和Aβ生成的促進(jìn)作用，從而打斷Aβ通過

14、激活BACE1-AS，增加BACE1 mRNA穩(wěn)定性，繼而增加BACE1含量和Aβ生成的正反饋循環(huán)機(jī)制。
　　 1.2外源性Aβ1-42在體內(nèi)促進(jìn)了C57BL/6J小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1的表達(dá)和Aβ的生成。與對(duì)照組相比，外源性Aβ1-42干預(yù)3天后，注射側(cè)海馬BACE1-AS、BACE1 mRNA的表達(dá)明顯升高，Aβ1-40的含量明顯增高。上述結(jié)果說明，立體定向注射后，外源性Aβ1-42在體內(nèi)同樣可以促進(jìn)小鼠腦內(nèi)B

15、ACE1-AS、BACE1的表達(dá)和Aβ生成。
　　 2.BACE1-AS參與APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BACE1表達(dá)和Aβ生成的作用機(jī)制。
　　 2.1APPsw基因轉(zhuǎn)入對(duì)細(xì)胞內(nèi)BACE1-AS、BACE1表達(dá)及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影響。穩(wěn)定轉(zhuǎn)入APPsw所得的20E2細(xì)胞內(nèi)BACE1-AS、BACE1 mRNA的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明顯高于HEK293細(xì)胞。這說明在APPsw

16、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)，同樣存在BACE1-AS表達(dá)的異常激活。
　　 2.2 siRNA抑制APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞20E2內(nèi)BACE1-AS表達(dá)對(duì)BACE1 mRNA和BACE1蛋白表達(dá)及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影響。采用siRNA干擾BACE1-AS的表達(dá)后，20E2細(xì)胞內(nèi)BACE1 mRNA和BACE1蛋白的含量均明顯降低，細(xì)胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明顯低于未處理組。這說明抑制BACE1-AS的表達(dá)，可以抑制

17、內(nèi)源性Aβ1-42通過促進(jìn)BACE1-AS異常表達(dá)所產(chǎn)生的正反饋循環(huán)，從而明顯減少Aβ的生成。
　　 3.NF-κB調(diào)節(jié)BACE1-AS表達(dá)和Aβ生成的作用機(jī)制。
　　 3.1NF-κB介導(dǎo)了外源性Aβ1-42對(duì)BACE1-AS表達(dá)的激活作用。在C57BL6J小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)立體定向注射入Aβ1-42后第3天，可以觀察到phospho-NF-κB p65含量的明顯增加。體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞在1μM的Aβ1-42處理

18、2hr后，phospho-NF-κB p65的含量明顯增加，而加用5μM的celastrol預(yù)處理則可使phospho-NF-κB p65的含量明顯減低。說明Aβ1-42在體內(nèi)外均可以促進(jìn)NF-κB的活化，celastrol可以抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NF-κB活化。采用celastrol抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NF-κB活化后，BACE1-AS、BACE1 mRNA的含量均明顯減少，細(xì)胞內(nèi)BACE1蛋白的含量和細(xì)胞外液Aβ1-40的含量也

19、明顯降低；而采用BACE1-AS siRNA干擾雖然可以抑制BACE1-AS表達(dá)的增強(qiáng)和Aβ1-40生成的增加，但不能抑制phospho-NF-κB p65含量的增加。由此，我們可以明確，NF-κB介導(dǎo)了外源性Aβ1-42對(duì)BACE1-AS表達(dá)和Aβ生成的促進(jìn)作用。
　　 3.2NF-κB介導(dǎo)了APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞20E2內(nèi)BACE1-AS表達(dá)的激活作用。20E2細(xì)胞內(nèi)phospho-NF-κB p65的含量明顯高于HEK293

20、細(xì)胞。這說明APPsw基因轉(zhuǎn)入在體內(nèi)外均可以引起NF-κB的異常激活。在20E2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5μM的celastrol抑制NF-κB的活性后，細(xì)胞內(nèi)BACE1-AS、BACE1 mRNA的表達(dá)明顯降低，BACE1蛋白的含量明顯降低，細(xì)胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明顯低于對(duì)照組。而采用BACE1-AS siRNA干擾雖然可以抑制BACE1-AS表達(dá)的增強(qiáng)和Aβ1-40、Aβ1-42生成的增加，但不能抑制phospho-N

21、F-κB p65含量的增加。這說明，NF-κB同樣介導(dǎo)了內(nèi)源性Aκ1-42對(duì)BACE1-AS表達(dá)以及Aβ生成的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.BACE1-AS介導(dǎo)了外源性Aβ1-42對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物BACE1表達(dá)和Aβ生成的促進(jìn)作用機(jī)制。
　　 2.BACE1-AS參與了APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BACE1表達(dá)和Aβ生成的作用機(jī)制。
　　 3.NF-κB介導(dǎo)了Aβ1-42促進(jìn)BACE1-AS表達(dá)以及Aβ生成的作