Ghrelin在肥胖發(fā)生機制中的實驗研究 及臨床意義探討.pdf

1、基礎(chǔ)實驗部分：
　　 本研究以3T3-L1前脂肪細胞為實驗對象，觀察ghrelin對其增殖、分化和凋亡的影響，并探討其可能的分子生物學機制，進而深化對ghrelin這一目前已知的唯一能夠促進食欲的外周激素的認識，深化對脂肪細胞增殖、分化和凋亡分子機制的認識，并進一步為肥胖及其相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的研究方向。
　　 第一部分：生長激素促分泌素受體-1a基因在脂肪細胞分化成熟中的作用研究
　　 目的：通過觀察生

2、長激素促分泌素受體-1a基因在3T3-L1前脂肪細胞誘導分化過程中不同時段表達水平的變化，從而進一步探討GHSR-1a基因在脂肪細胞分化過程中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，采用經(jīng)典的激素雞尾酒誘導分化法誘導3T3-L1前脂肪細胞分化。在誘導其向成熟脂肪細胞分化的不同時段，采用光學顯微鏡觀察脂肪細胞的形態(tài)學變化及細胞內(nèi)脂滴的形成，通過油紅O染色測定脂肪細胞分化程度及細胞內(nèi)脂滴的聚積情況，采用化學比色法測定脂

3、肪細胞中甘油三酯的總量，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測脂肪細胞中GHSR-1a基因mRNA表達水平的變化。
　　 結(jié)果：誘導分化前，3T3-L1 前脂肪細胞呈梭形的成纖維細胞形態(tài)，胞漿內(nèi)無脂滴；誘導分化第4天時，脂肪細胞變大、變圓，胞漿中出現(xiàn)脂滴；分化第6天時，細胞進一步變大、變圓，脂滴明顯增多，分布于核周圍，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)，從形態(tài)上由前脂肪細胞向成熟脂肪細胞轉(zhuǎn)變；分化第8天時，胞漿中更多的脂滴積聚，大多數(shù)細胞分化成

4、熟。分化第4天時，脂肪細胞的TG總量明顯升高，分化第8天時TG總量進一步升高，與前脂肪細胞和對照組相比差異均有極顯著的統(tǒng)計學意義。同時，GHSR-1a基因mRNA低表達于3T3-L1前脂肪細胞和分化第1天的脂肪細胞，隨著脂肪細胞逐漸分化成熟，分化第4天和第8天時GHSR-1a基因mRNA的表達逐漸增加，分別是前脂肪細胞的1.7倍和1.9倍，差異均有顯著的統(tǒng)計學意義；分化第8天時GHSR-1a基因mRNA的表達分別是分化第1天和第4天的1

5、.3倍和1.1倍，差異均有顯著的統(tǒng)計學意義；GHSR-1a基因mRNA的表達水平除在誘導分化第0～1天和第1～4天內(nèi)差異無統(tǒng)計學意義外，其余各時間段間表達水平差異均有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：經(jīng)典的激素雞尾酒誘導分化法能夠誘導3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，并且能夠顯著增加前脂肪細胞分化過程中甘油三酯的積累。3T3-L1前脂肪細胞分化過程中GHSR-1a基因表達逐漸上調(diào)，其表達變化與脂肪細胞分化、脂質(zhì)積聚過程相一

6、致，可能參與了脂肪細胞分化過程。
　　 第二部分：Ghrelin對前脂肪細胞增殖的作用及相關(guān)機制的研究
　　 目的：觀察不同濃度ghrelin對3T3-L1前脂肪細胞增殖活力的影響，進而探討其可能的作用機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，采用MTT法檢測不同濃度ghrelin對其增殖活力的影響，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測ghrelin對前脂肪細胞c-myc和胸苷激酶基因mRNA表達水平的影響。

7、
　　 結(jié)果：10-7～10-15mol/L ghrelin作用24h均能明顯促進3T3-L1前脂肪細胞增殖，其中10-11mol/L時促增殖效應(yīng)最明顯，而且同一濃度ghrelin促進前脂肪細胞增殖的效應(yīng)隨作用時間的延長而提高；ghrelin干預(yù)后前脂肪細胞c-myc和胸苷激酶基因mRNA表達水平明顯升高，與對照組相比差異均有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：Ghrelin能夠促進3T3-L1前脂肪細胞增殖。Ghrelin

8、可能通過增加c-myc的含量，進而引起胸苷激酶的活化，從而導致細胞周期的激活，促進細胞增殖。
　　 第三部分：Ghrelin誘導前脂肪細胞分化過程中形態(tài)學觀察、甘油三酯總量變化及分化轉(zhuǎn)錄因子表達的研究
　　 目的：通過觀察ghrelin誘導3T3-L1前脂肪細胞分化過程中的形態(tài)學變化，測定分化過程中甘油三酯在細胞中的累積情況，檢測分化過程中分化轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，進而探討ghrelin誘導脂肪細胞分化的作用機制。

9、　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，采用經(jīng)典的激素雞尾酒誘導分化法以及ghrelin誘導其分化。在誘導其向成熟脂肪細胞分化的不同時段，采用光學顯微鏡觀察脂肪細胞的形態(tài)學變化及細胞內(nèi)脂滴的形成，通過油紅O染色測定脂肪細胞分化程度及脂滴的聚積情況，采用化學比色法測定脂肪細胞TG總量，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測脂肪細胞中過氧化物酶體增殖劑活化受體γ、CAAT/增強子結(jié)合蛋白α基因mRNA的表達情況。
　　 結(jié)果：3T3-

10、L1前脂肪細胞呈典型的梭形，胞漿中無脂滴，形態(tài)與成纖維細胞相似。Ghrelin誘導分化第4天時，細胞形態(tài)開始變圓，僅少量細胞中出現(xiàn)細小的脂滴；分化第6天時，細胞變圓，體積稍變大，胞漿中脂滴增多，聚集在細胞核周圍；分化第8天時，細胞明顯變大、變圓，胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴，脂滴分布于核周圍，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)。10-11mol/L ghrelin誘導3T3-L1前脂肪細胞的分化率可達70%，而激素雞尾酒誘導分化組為90%。誘導分化第4天時，g

11、hrelin組脂肪細胞的TG總量明顯升高，與前脂肪細胞和對照組相比差異均有極顯著的統(tǒng)計學意義；分化第8天時，TG總量進一步升高，與前脂肪細胞、分化第4天時的脂肪細胞和對照組相比差異均有極顯著的統(tǒng)計學意義。Ghrelin誘導分化第4天時，PPARγ基因mRNA表達水平較對照組升高，是對照組的1.77倍，差異有極顯著的統(tǒng)計學意義；分化第8天時，PPARγ基因mRNA表達進一步升高，分別是對照組和分化第4天時的1.62倍和1.81倍，差異均有

12、極顯著的統(tǒng)計學意義。而ghrelin組與同分化時間點Insulin組比較，差異沒有顯著的統(tǒng)計學意義。Ghrelin誘導分化第4天時，C/EBPα基因mRNA表達水平較對照組升高，是對照組的1.44倍，差異有極顯著的統(tǒng)計學意義；分化第8天時，C/EBPα基因mRNA表達進一步升高，分別是對照組和分化第4天時的1.44倍和2.08倍，差異均有極顯著的統(tǒng)計學意義。而ghrelin組與同分化時間點Insulin組比較，分化第4天時差異沒有顯著的

13、統(tǒng)計學意義，分化第8天時差異有極顯著的統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：Ghrelin具有誘導3T3-L1前脂肪細胞分化的生物學作用，PPARγ、C/EBPα隨著脂肪細胞分化的進行表達水平逐漸升高，并發(fā)揮協(xié)同作用，直至終末分化期。這提示在ghrelin誘導前脂肪細胞分化過程中，PPARγ、C/EBPα對細胞完成終末分化具有重要意義。
　　 第四部分：Ghrelin對前脂肪細胞凋亡的作用及相關(guān)機制的研究
　　 目的：通過觀

14、察不同濃度ghrelin對3T3-L1前脂肪細胞凋亡率和細胞周期的影響，以及p-ERK1/2和p-Akt蛋白表達水平的變化，進而探討ghrelin對3T3-L1前脂肪細胞凋亡的作用及分子機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞儀分析不同濃度ghrelin對3T3-L1前脂肪細胞凋亡率的影響；采用PI單染流式細胞儀檢測細胞周期的構(gòu)成；采用Western blot方法檢測

15、ghrelin干預(yù)后脂肪細胞p-ERK1/2和p-Akt蛋白表達水平的變化。
　　 結(jié)果：10-7～10-15mol/L ghrelin組細胞凋亡率與對照組細胞凋亡率顯著降低，流式細胞儀細胞周期分析顯示10-11mol/L ghrelin干預(yù)后，3T3-L1前脂肪細胞處于亞二倍體峰的細胞數(shù)明顯減少，而G0/G1，S和G2/M期細胞數(shù)基本不變。10-7～10-15mol/L ghrelin均可以引起前脂肪細胞和成熟脂肪細胞ERK1

16、/2快速而強烈的活化，然而ghrelin誘導的ERK1/2的活化在脂肪細胞分化早期雖然與對照組相比明顯升高，但是與分化前和成熟脂肪細胞相比卻是明顯減弱的；同時在前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中，ghrelin誘導的ERK1/2的活化可早至ghrelin刺激后2min，在5～10min達到作用高峰，持續(xù)至少30min以上，然而在脂肪細胞分化早期，ERK1/2的活化持續(xù)僅不足10min。10-9～10-15mol/L ghrelin均可以引起前脂

17、肪細胞和成熟脂肪細胞Akt的活化，同時在前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中，ghrelin刺激30min后即可檢測到p-Akt蛋白的高水平表達，并且持續(xù)高水平表達可達24h。
　　 結(jié)論：Ghrelin可以抑制3T3-L1前脂肪細胞凋亡，而ERK1/2和PI3K/Akt信號通路可能參與了ghrelin調(diào)節(jié)細胞凋亡的過程。
　　 臨床實驗部分：
　　 目的：檢測單純性肥胖癥兒童血漿ghrelin的水平，并進一步探討ghre

18、lin與兒童肥胖相關(guān)指標的關(guān)系及其臨床意義。
　　 方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測肥胖組32例兒童和正常對照組35例兒童血漿ghrelin水平，同時檢測各組兒童血胰島素、甘油三酯、膽固醇水平，并分析ghrelin與胰島素、甘油三酯、膽固醇的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：單純性肥胖癥兒童血漿ghrelin水平降低，且與胰島素、甘油三酯呈顯著負相關(guān)，這提示ghrelin是一個反映機體營養(yǎng)狀態(tài)的標志，并且以負反饋的模式參與對能量代