腦震蕩對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其神經(jīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:腦震蕩(concussive brain injury, CBI)屬于輕型腦外傷(mild traumatic brain injury),是最常見的腦損傷形式之一,多見于交通事故和各種暴力案件。腦震蕩的臨床特征是腦外傷后出現(xiàn)短暫的意識(shí)喪失不伴有明顯的腦內(nèi)結(jié)構(gòu)損害,常可遺留包括學(xué)習(xí)記憶功能障礙在內(nèi)的一系列癥狀,這些癥群可長期存在,被稱為腦震蕩后綜合征(post-concussion syndrome,PCS)。在人類腦震蕩中

2、學(xué)習(xí)記憶障礙是 PCS中最持久和對(duì)人們健康生活影響最嚴(yán)重的問題之一,然而這并未引起人們的足夠重視,這方面的研究也缺乏系統(tǒng)性。相當(dāng)一部分腦震蕩病例的發(fā)生都要涉及到法律訴訟問題,而基于上述原因,對(duì)腦震蕩引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的法醫(yī)學(xué)鑒定尚缺乏科學(xué)依據(jù);對(duì)腦震蕩的臨床治療也還有待于進(jìn)一步的提高認(rèn)識(shí)。所以,建立腦震蕩的動(dòng)物模型,系統(tǒng)研究腦震蕩對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響及其神經(jīng)機(jī)制,對(duì)腦震蕩的法醫(yī)學(xué)鑒定、腦震蕩的臨床治療等諸多方面都具有重要意義。
　　材

3、料和方法:84只大鼠隨機(jī)分成10組,A、C、E、G、I、J組為腦震蕩打擊組,每組10只;B、D、F、H組為非打擊組,每組6只。為觀察腦震蕩對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶的影響,A組于打擊前行水迷宮訓(xùn)練,打擊后檢測其記憶保持情況,B為對(duì)照組;C組打擊后檢測其空間學(xué)習(xí)能力、參照記憶和工作記憶能力,D組為對(duì)照組。
　　為探討腦震蕩對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響的神經(jīng)機(jī)制,E組于打擊后72小時(shí)處死,取腦組織檢測海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞凋亡情況,F組為對(duì)照組。

4、G組、I組和 J組分別于打擊后給予生理鹽水、納洛酮和多巴胺 D2受體拮抗劑舒必利腹腔注射,H組給予生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照組,7天后用水迷宮技術(shù)檢測上述四組動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。打擊后14天動(dòng)物被處死后取腦組織,一側(cè)腦組織用于激光共聚焦顯微鏡檢測海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi) Ca2+積聚情況,另一側(cè)腦組織制成組織蠟塊后,切片進(jìn)行海馬 CA3錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1)打擊后24小時(shí) A組動(dòng)物探索試驗(yàn)穿越原平臺(tái)位置水域次

5、數(shù)明顯比 B組動(dòng)物少(P<0.05),打擊后48、72小時(shí)兩組動(dòng)物探索試驗(yàn)無差異(P>0.05)。提示動(dòng)物腦震蕩后出現(xiàn)了一過性逆行性遺忘,48小時(shí)后恢復(fù)。
　　2)打擊后第8至13天 C組動(dòng)物隱匿平臺(tái)逃避潛伏期明顯比 D組動(dòng)物長(P<0.05),第13天進(jìn)行的探索試驗(yàn) C組動(dòng)物穿越原平臺(tái)位置水域的次數(shù)明顯比D組動(dòng)物少(P<0.05),可見平臺(tái)試驗(yàn)無差異(P>0.05),提示腦震蕩對(duì)動(dòng)物參照記憶的獲得和保持均有影響,并排除了腦震蕩后

6、動(dòng)物感覺和運(yùn)動(dòng)功能改變的影響。第15至18天的工作記憶檢測,C組動(dòng)物每天的第一次嘗試和第二次嘗試逃避潛伏期的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),D組動(dòng)物每天的第一次嘗試和第二次嘗試逃避潛伏期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示腦震蕩損害了動(dòng)物的工作記憶
　　3)G組(腦震蕩+生理鹽水組)、H組(假打擊+生理鹽水組)、I組(腦震蕩+納洛酮組)和 J組(腦震蕩+舒必利組)各組動(dòng)物水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果:從打擊后第8至13天,每天比較,

7、G組動(dòng)物的隱匿平臺(tái)逃避潛伏期明顯比 H、I、J組動(dòng)物長(P<0.01),H、I、J組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。第14天探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果:H、I、J組動(dòng)物的穿越次數(shù)明顯比 G組多(P<0.01)。H、I、J組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明,腦震蕩損害了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;納洛酮以及舒必利均能明顯改善腦震蕩后大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　4)E組(腦震蕩組)海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞層見大量 TUNEL陽性細(xì)胞,F組(

8、假打擊組)海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞層偶見 TUNEL陽性細(xì)胞,病理圖像分析結(jié)果顯示,E組的海馬 CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)、凋亡細(xì)胞平均光密度、凋亡細(xì)胞面密度以及數(shù)密度均明顯高于 F組(P<0.01)。E組凋亡細(xì)胞平均灰度值明顯低于 F組(P<0.01)。E組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生以下變化:線粒體腫脹,嵴減少,空泡樣變性;核膜皺縮,染色質(zhì)邊集。F組動(dòng)物未見上述改變。E組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變符合凋亡特征。說明腦

9、震蕩能引起大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞凋亡,凋亡是腦震蕩大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞選擇性丟失的主要機(jī)制之一。
　　5)G組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)游離鈣熒光探針 fluo-3/AM的熒光量組明顯高于 H、I、J組(P<0.01),說明腦震蕩導(dǎo)致大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)游離鈣積聚,提示腦震蕩后大鼠海馬內(nèi)谷氨酸釋放增多,發(fā)生了 Ca2+-興奮偶聯(lián),納洛酮和舒必利兩種藥物均能減少腦震蕩動(dòng)物海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚。H、I

10、、J組之間無明顯差異(P>0.05)。
　　6)G、I、J組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)平均值明顯比 H組低(P<0.01),說明腦震蕩導(dǎo)致了大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞的丟失;I、J組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值明顯比 G組高(P<0.01),說明腦震蕩后納洛酮和舒必利兩種藥物均對(duì)動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞有保護(hù)作用。I組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值明顯比 J組高(P<0.01),說明納洛酮對(duì)腦震蕩后大鼠海馬 CA

11、3區(qū)錐體細(xì)胞的保護(hù)作用效果比舒必利好。
　　結(jié)論:
　　1)腦震蕩打擊后,大鼠出現(xiàn)了類似人類腦震蕩的一過性逆行性遺忘和長達(dá)18天的空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙。
　　2)大鼠腦震蕩后學(xué)習(xí)記憶缺失與海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞減少有關(guān)。
　　3)腦震蕩大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞凋亡試驗(yàn)呈陽性,提示凋亡是大鼠腦震蕩后海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞減少的主要途徑之一。
　　4)腦震蕩大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi) Ca2+積聚明顯,提示

12、腦震蕩后海馬內(nèi)興奮毒性氨基酸釋放增多并參與了海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞的損害機(jī)制。
　　5)納洛酮和舒必利均能明顯減輕腦震蕩大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶缺失,減輕腦震蕩后 CA3區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi) Ca2+積聚,納洛酮和舒必利治療組動(dòng)物海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯比對(duì)照組多,提示腦震蕩后腦內(nèi)內(nèi)源性阿片肽和多巴胺的增多引起海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞損害,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力受損。這一研究結(jié)果為腦震蕩后學(xué)習(xí)記憶缺失的臨床治療提供了新的途徑,也對(duì)腦震蕩對(duì)學(xué)習(xí)記憶