小麥漸滲系山融4號(hào)根系堿脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組及相關(guān)基因功能研究.pdf

1、土壤鹽漬化是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素。堿性土壤呈高pH，易板結(jié)，通透性差，肥力低。研究表明，土壤的堿化是由于土壤中含有大量的NaHCO3和Na2CO3成分，造成土壤具有較高的pH，這種堿性土壤往往比含有NaCl和Na2SO4等中性鹽的土壤給植物造成更為嚴(yán)重的傷害。目前對(duì)植物的耐鹽機(jī)制已經(jīng)有了廣泛的研究，但對(duì)植物堿脅迫抗性機(jī)制的研究還很少，因此迫切需要加強(qiáng)植物尤其是農(nóng)作物耐堿機(jī)制的研究。
　　1、山融4號(hào)是研究小麥耐堿機(jī)理和耐堿功能基

2、因篩選的良好材料
　　山融4號(hào)(Shanrong No.4，簡(jiǎn)稱(chēng)SR4)是從普通小麥濟(jì)南177（Triticumaestivum L.2n=42）與其耐鹽堿近緣屬長(zhǎng)穗偃麥草（Thinopyrum ponticum2n=70）不對(duì)稱(chēng)體細(xì)胞融合雜種中篩選出來(lái)的耐鹽漸滲系新品種。在本論文中，我們對(duì)山融4號(hào)和對(duì)照品種在不同鹽堿地、鹽堿池中的產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。2013年，在東營(yíng)市孤島馬場(chǎng)的鹽堿地中山融4號(hào)和小麥漸滲系耐鹽品種山融3號(hào)的生長(zhǎng)

3、狀況遠(yuǎn)好于它們的對(duì)照親本濟(jì)南177，另外在濰坊市寒亭鹽堿地中山融4號(hào)的表現(xiàn)也好于耐鹽小麥的對(duì)照品種德抗961。2014年，在東營(yíng)市墾利縣鹽堿地的種植實(shí)驗(yàn)中，山融4號(hào)較山融3號(hào)和濟(jì)南177分別增產(chǎn)15.0％和35.4％。在東營(yíng)市孤島鹽堿地的種植實(shí)驗(yàn)中，山融4號(hào)較山融3號(hào)和濟(jì)南177分別增產(chǎn)18.6％和42.4％。在人工澆灌的堿池中，山融4號(hào)的產(chǎn)量也明顯高于濟(jì)南177和山融3號(hào)。綜合上述結(jié)果表明山融4號(hào)具有很強(qiáng)的耐堿性。
　　2、利用

4、第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析小麥根系堿脅迫相關(guān)功能基因
　　我們觀察了濟(jì)南177和山融4號(hào)幼苗期在堿脅迫下的表型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山融4號(hào)在幼苗期的生長(zhǎng)發(fā)育明顯優(yōu)于親本濟(jì)南177。葉片及根中各項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)定顯示，山融4號(hào)在脯氨酸含量及各種清除酶活性上均優(yōu)于濟(jì)南177，而Na+/K+和丙二醛(MDA)含量則低于濟(jì)南177。我們利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)分析了對(duì)照條件及堿處理0.5h及24 h條件下，濟(jì)南177和山融4號(hào)中的基因表達(dá)變化。

5、在六組樣品中，我們一共獲得了2814938個(gè)原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)篩選后有1229902條高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過(guò)與參考數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，有123730條基因得到注釋。研究發(fā)現(xiàn)，在這兩種不同品種的小麥中，堿脅迫條件下差異表達(dá)基因的GO分析富集的途徑是非常相似的，主要集中在各種化合物的代謝過(guò)程、脅迫響應(yīng)途徑及物質(zhì)運(yùn)輸途徑。堿脅迫條件下，山融4號(hào)在吸收營(yíng)養(yǎng)所需的陰離子和陽(yáng)離子，維持植物體內(nèi)pH及根系周?chē)h(huán)境pH，有效地清除活性氧及表觀遺傳修飾的相關(guān)基因具有表

6、達(dá)優(yōu)勢(shì)，可能參與到山融4號(hào)對(duì)堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制。
　　3、Aux/IAA蛋白家族基因TaIAA10影響植物對(duì)堿脅迫的抗性
　　在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們找到了一個(gè)在堿脅迫下表達(dá)發(fā)生變化、且在山融4號(hào)和濟(jì)南177中變化趨勢(shì)不同的生長(zhǎng)素早期響應(yīng)Aux/IAA蛋白家族基因TaIAA10。之前有研究表明，生長(zhǎng)素可以減少堿脅迫的抑制作用，但是具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，所以我們研究了生長(zhǎng)素是否影響山融4號(hào)對(duì)堿脅迫的響應(yīng)。通過(guò)觀察比較對(duì)照條件、單獨(dú)

7、的堿脅迫條件及同時(shí)施加生長(zhǎng)素和堿脅迫條件下山融4號(hào)的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素的添加減弱了堿脅迫對(duì)山融4號(hào)生長(zhǎng)的抑制作用。為了驗(yàn)證TaIAA10基因的功能，我們構(gòu)建了該基因的小麥過(guò)表達(dá)株系(OX)及擬南芥過(guò)表達(dá)系(OE)。表型分析顯示，在堿脅迫條件下，野生型小麥葉片明顯萎蔫，葉片變黃，OX系葉片呈現(xiàn)綠色，根長(zhǎng)大子野生型，表明TaIAA10提高了小麥對(duì)堿脅迫的抗性。在NaHCO3及堿性pH處理?xiàng)l件下，擬南芥OE系與野生型在萌發(fā)率上沒(méi)有明顯區(qū)別，

8、但萌發(fā)后幼苗的生長(zhǎng)明顯好于野生型。幼苗期，OE系在堿性pH條件下的葉片生長(zhǎng)及根的相對(duì)生長(zhǎng)要明顯好于野生型。以上結(jié)果表明:TaIAA10可能參與植物對(duì)堿脅迫的響應(yīng)過(guò)程。
　　4、Aux/IAA蛋白家族基因TaIAA10影響植物發(fā)育
　　TaIAA10編碼一個(gè)Aux/IAA蛋白，主要在細(xì)胞核中定位，具有該蛋白家族的四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。TaIAA10與短柄草、水稻、高粱及玉米等禾本科植物中同源基因相似性較高。TaIAA10過(guò)表達(dá)不影響

9、擬南芥種子的萌發(fā)率，但是抑制了幼苗子葉和根的生長(zhǎng)，同時(shí)導(dǎo)致下胚軸伸長(zhǎng)。另外，OX的地上部分，OE系的下胚軸和根喪失了重力性反應(yīng)。觀察正常條件下生長(zhǎng)約一周的野生型及OE系，我們發(fā)現(xiàn)，OE系不能形成側(cè)根。AtLBD29基因在OE系中的表達(dá)量明顯低于野生型，可能與OE系不能形成側(cè)根相關(guān)。與野生型相比，白光下OE系的下胚軸更長(zhǎng)，黑暗下、遠(yuǎn)紅光和藍(lán)光條件下則比野生型短，表明TaIAA10參與了光形態(tài)建成過(guò)程。TaIAA10的表達(dá)量受到NAA的誘導(dǎo)

10、，在24 h恢復(fù)至對(duì)照水平。OE系植株表現(xiàn)出對(duì)高濃度生長(zhǎng)素的不敏感性，表明TaIAA10可能通過(guò)植物體內(nèi)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控植物的發(fā)育。
　　5、TaIAA10通過(guò)ABA合成和信號(hào)途徑提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性
　　利用OE系進(jìn)一步探討TaIAA10提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性機(jī)理。在外源添加ABA條件下，OE系在萌發(fā)后幼苗形成及幼苗期的根的生長(zhǎng)上表現(xiàn)出更高的耐受性。進(jìn)一步分析顯示，OE系中ABA合成途徑中關(guān)鍵酶AtNCED3

11、及ABA依賴(lài)的脅迫應(yīng)答途徑中的AtMYC2、AtRD29B和AtRAB18的表達(dá)顯著上調(diào);AtABI3、AtABI4和AtABI5的表達(dá)量顯著下調(diào)。擬南芥OE系在滲透脅迫條件下，幼苗期的相對(duì)根伸長(zhǎng)比野生型要高，表現(xiàn)出對(duì)滲透脅迫的抗性。氧化脅迫條件下，OE系與野生型相比，敏感性降低。OE系中AtAPX2及AtSOD的表達(dá)量上調(diào)。與后兩種脅迫處理相比，OE系在ABA處理?xiàng)l件下的表型更明顯，且ABA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化更大。綜合以上結(jié)果