NAD（P）H氧化酶在TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細胞上調(diào)表達炎癥因子及轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、本研究旨在探討NADH氧化酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在TGF-β1刺激大鼠腎小管上皮細胞上調(diào)表達炎癥因子、細胞外基質(zhì)積聚及細胞轉(zhuǎn)分化過程中的作用及可能機制，為進一步探討腎臟纖維化的防治措施提供新的途徑和方法。 第一章NADH氧化酶在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細胞ROS產(chǎn)生中的作用 目的：探討NADH氧化酶在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細胞ROS產(chǎn)生中的作用。 材料和方法： 1.細胞培養(yǎng)及分組 正常培

2、養(yǎng)的NRK-52E細胞株無血清培養(yǎng)24h后進行實驗。然后用TGF-β和NRK-52E細胞共同孵育，觀察TGF-β1刺激不同時間點對NADH氧化酶各亞單位表達的影響；同時觀察TGF-β1刺激后細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響，部分實驗采用NADH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理1h或轉(zhuǎn)染shRNA，分別收集總RNA和蛋白以備檢測。 2.方法 分別用RT-PCR檢測NADH氧化酶p47phox、p67phox、p22phox、gp91phox

3、mRNA的表達；用熒光探針及激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；Westernblot檢測NADH氧化酶亞單位p67phox的蛋白表達。 3.統(tǒng)計學(xué)分析計量 資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1.TGF-β1對NRK-52E細胞NADH氧化酶表達的影響及shRNA-p67phox的作用 NRK-52E細胞經(jīng)TGF-β1刺激以后，

4、NADH氧化酶亞單位p67phoxmRNA的表達逐漸增加，而TGF-β1刺激后，NADH氧化酶亞單位的表達無明顯改變。RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，p67phoxmRNA的表達在基礎(chǔ)水平和TGF-β1刺激后均有下調(diào)。同樣，Westernblot結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，p67phox蛋白的表達在基礎(chǔ)水平和TGF-β1刺激后均有下調(diào)。 2.DPI及shRNA-p67p

5、hox對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細胞ROS產(chǎn)生的影響 TGF-β1刺激5min可明顯增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，為正常水平的2.5倍。DPI預(yù)處理后，可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，較TGF-β1刺激刺激組降低了43.69％。同樣，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生在基礎(chǔ)水平和TGF-β1刺激后均有下調(diào)。 小結(jié)： 1.TGF-β1可刺激大鼠腎小管上皮細胞NAD

6、H氧化酶亞單位p67phox的表達上調(diào)及ROS產(chǎn)生增加； 2.抑制NADH氧化酶活性可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細胞ROS的產(chǎn)生。 3.沉默NADH氧化酶p67phox亞單位可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細胞ROS的產(chǎn)生。 第二章NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細胞炎癥因子上調(diào)表達中的作用 目的：探討NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細胞

7、合成和分泌炎癥因子中的作用。 材料和方法： 同第一章。 結(jié)果： 1.TGF-β1對大鼠腎小管上皮細胞MCP-1表達的影響及DPI和shRNA-p67phox的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，正常細胞僅有少量MCP-1的表達，TGF-β1可明顯上調(diào)MCP-1的mRNA表達，使用DPI不同濃度預(yù)處理1h后，TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1mRNA表達明顯受到抑制。ELISA結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相似，TG

8、F-β1可明顯增加上清液中MCP-1的濃度，12h開始明顯增加，隨著時間延長，蛋白量逐漸增加，72h達最高。不同濃度DPI預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1蛋白的生成明顯受到抑制。0.5％DMSO對MCP-1mRNA和蛋白的表達均無抑制作用。RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染shRNA-p67phox后，MCP-1mRNA的表達在基礎(chǔ)水平分別下降了45.36％和52.01％。 2.TGF-β1對大鼠腎小管上皮細胞I

9、L-6表達的影響以及DPI和shRNA-p67phox的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，IL-6mRNA表達逐漸增強DPI預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的IL-6mRNA的表達明顯受到抑制，DMSO對IL-6mRNA的表達無抑制作用。 小結(jié)： 1.TGF-β1可促使大鼠腎小管上皮細胞上調(diào)表達炎癥因子MCP-1和IL-6。 2.抑制NADH氧化酶活性可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮

10、細胞MCP-1和IL-6的上調(diào)表達。 3.沉默NADH氧化酶p67phox亞單位可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細胞MCP-1和IL-6的上調(diào)表達。 第三章NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細胞細胞外基質(zhì)積聚中的作用 目的：NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細胞細胞外基質(zhì)積聚中的作用。 材料和方法： 同第二章。 結(jié)果： 1.TGF-

11、β1對大鼠腎小管上皮細胞COL-I表達的影響及DPI的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β可明顯增加COL-ImRNA的表達，Westernblot結(jié)果也顯示，TGF-β1可明顯增加COL-I蛋白的合成，與RNA表達趨勢相一致。RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1可明顯增加COL-ImRNA的表達，與TGF-β1組比較，DPI組COL-ImRNA的表達明顯受到抑制，Westernblot結(jié)果也顯示，DPI可明顯抑制COL-I

12、蛋白的表達，較單純TGF-β1刺激組下降了40.85％。 2.TGF-β1對大鼠腎小管上皮細胞PAI-1表達的影響及DPI的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，PAI-1mRNA表達逐漸增強，Westernblot結(jié)果也顯示，TGF-β1可明顯增加PAI-1蛋白的合成，RT-PCR結(jié)果也顯示，TGF-β1可明顯增加PAI-1mRNA的表達，DPI組PAI-1mRNA的表達明顯受到抑制，Westernblo

13、t結(jié)果也顯示，DPI組PAI-1蛋白的表達明顯受到抑制。 小結(jié)： 1.TGF-β1可明顯上調(diào)大鼠腎小管上皮細胞PAI-1和COL-I的表達，促進細胞外基質(zhì)的積聚。 2.抑制NADH氧化酶活性可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細胞PAI-1和COL-I的表達。 第四章NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細胞轉(zhuǎn)分化中的作用 目的：NADH氧化酶/ROS在TGF-β1誘導(dǎo)的大

14、鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。 材料和方法： 同第二章。 結(jié)果： 1.TGF-β1對大鼠腎小管上皮細胞α-SMA表達的影響及DPI的干預(yù)作用 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，α-SMAmRNA表達逐漸增強，免疫熒光結(jié)果也顯示，正常對照組α-SMA幾乎看不到，TGF-β1刺激組，α-SMA的陽性信號明顯增加。Westernblot結(jié)果進一步證實，TGF-β1可明顯增加α-SMA蛋白的表達

15、，隨著時間的延長，蛋白表達逐漸增加，DPI預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA蛋白的生成明顯受到抑制，DMSO對α-SMA的表達無顯著作用。 2.TGF-β1對大鼠腎小管上皮細胞E-Cadherin表達的影響及DPI的作用 RT-PCR結(jié)果顯示，NRK-52E細胞經(jīng)TGF-β1刺激后，E-CadherinmRNA的表達逐漸降低，免疫熒光結(jié)果也顯示，正常對照組E-Cadherin在細胞膜表達完整，TGF-β1刺激組，E-

16、Cadherin的表達明顯降低。Westernblot結(jié)果顯示，TGF-β1可顯著降低E-Cadherin蛋白的表達，與基因水平相一致。RT-PCR結(jié)果顯示，DPI組TGF-β1誘導(dǎo)的E-Cadherin的下調(diào)得到改善，0.5％DMSO對E-Cadherin的表達無顯著作用。 小結(jié)： 1.TGF-β1可明顯上調(diào)α-SMAmRNA和蛋白的表達，同時下調(diào)E-CadherinmRNA和蛋白的表達，促進腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化；

17、 2.抑制NADH氧化酶活性可部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞α-SMA的上調(diào)表達及E-Cadhedn的下調(diào)表達。 總結(jié)： 1.TGF-β1可刺激大鼠腎小管上皮細胞NADH氧化酶亞單位p67phox表達上調(diào)及增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生； 2.TGF-β1可刺激大鼠腎小管上皮細胞合成與分泌炎癥因子增加，抑制NADH氧化酶的活性和表達可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1和IL-6的上調(diào)表達； 3.TG