新型可塑形同種骨修復(fù)材料的制備及相關(guān)研究.pdf

1、第一章、脂肪酶用于骨移植材料脫脂的可行性研究
　　 目的:應(yīng)用脂肪酶對骨組織進(jìn)行脫脂，檢測脫脂處理骨材料的脂肪含量、表面結(jié)構(gòu)、對MC3T3-E1小鼠成骨前體細(xì)胞增殖影響、細(xì)胞相容性及組織相容性，評價脂肪酶用于骨移植材料脫脂過程的可行性。
　　 方法:取新鮮豬股骨，置于-76℃深低溫冰箱中凍存兩周，去除軟組織，鋸成骨條或骨小塊，超聲清洗48h。平均分成四組進(jìn)行脫脂處理，分別為:脂肪酶處理組:40℃條件下，PH=10的1％濃

2、度的脂肪酶溶液中浸泡4h; NaHCO3/Na2CO3處理組:PH=10的NaHCO3/Na2CO3溶液中浸泡4h;丙酮處理組（陽性對照）:丙酮溶液中浸泡24h，再用無水乙醇浸泡36h去除丙酮;純化水處理組（陰性對照）:在純化水中浸泡4h。脫脂過程結(jié)束后再超聲清洗12h，冷凍干燥。索式提取法浸提各組骨材料，根據(jù)浸提前后重量差計算各組骨材料中脂肪含量。掃描電子顯微鏡觀察各組骨材料表面結(jié)構(gòu)，組織學(xué)切片，HE和Masson三色染色，觀察材料內(nèi)

3、部結(jié)構(gòu)。取各組骨材料，輻照滅菌，H-DMEM培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，按0.2g骨材料/ml培養(yǎng)基比例，在37℃條件下浸提72h，制備各組骨材料浸提液，以H-DMEM培養(yǎng)基為試劑對照、無毒性聚乙烯片為陰性對照、苯酚為陽性對照。取指數(shù)生長期MC3T3-E1小鼠成骨前體細(xì)胞調(diào)整濃度為1×104個/ml，按100μL/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，換用各組浸提液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在浸提液培養(yǎng)的第1，4，7d，每孔加入CCK-8試劑10μL

4、，培養(yǎng)箱中孵育6h后，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值，計算細(xì)胞增殖率并評價細(xì)胞毒性級別。取各組骨材料，置于6孔培養(yǎng)板，取指數(shù)生長期MC3T3-E1小鼠成骨前體細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/ml，按每塊材料500μL細(xì)胞懸液接種到各組骨材料，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h后，加培養(yǎng)基至足量，培養(yǎng)7d后，取出骨材料-細(xì)胞復(fù)合物，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在各組骨材料上的生長情況。取各組骨材料分別埋入大鼠脊柱兩側(cè)皮下，分別于術(shù)后的第1，4，12周隨機(jī)選取3只動物

5、處死，取材，組織學(xué)切片，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。
　　 結(jié)果:脫脂處理后，脂肪酶、丙酮脫脂及Na2CO3/NaHCO3處理組骨材料表面清潔，無油漬，純化水浸泡骨材料表面可見油漬。輻照滅菌后，脂肪酶和丙酮處理組骨材料顏色潔白，Na2CO3/NaHCO3處理組骨材料呈微黃色，純化水清洗的骨材料顏色更黃。脂肪酶處理組骨材料脂肪含量（0.46±0.16％）與丙酮處理組（1.11±0.13％）相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.065

6、)，均低于Na2CO3/NaHCO3處理組(3.46±0.69％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);純化水組骨材料脂肪含量(8.88±0.18％)高于其他組別，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。掃描電鏡觀察，脂肪酶及丙酮處理組骨小梁表面結(jié)構(gòu)保持完整，僅有少量細(xì)胞碎片附著;Na2CO3/NaHCO3處理組骨材料表面有小脂滴及細(xì)胞碎片;純化水處理組骨材料可見大量脂肪滴覆蓋在骨小梁表面。組織學(xué)觀察，脂肪酶處理組在材料淺層及中心部位骨小梁

7、間隙內(nèi)均未見殘留骨髓組織及細(xì)胞碎片;Na2CO3/NaHCO3處理組骨材料深層的骨小梁間隙內(nèi)可見少量殘留細(xì)胞碎片;丙酮處理組骨材料在中心部位偶見細(xì)胞碎片;純化水處理組骨材料骨小梁間隙內(nèi)可見殘留骨髓組織，部分殘留組織連接成片。Masson三色染色顯示各組骨材料的骨小梁中的膠原纖維排列有序，未見膠原纖維損傷斷裂。對MC3T3-E1小鼠成骨前體細(xì)胞的細(xì)胞毒性評級結(jié)果顯示，脂肪酶處理組及丙酮處理組骨材料在第1，4，7d的細(xì)胞毒性為0級或1級;N

8、a2CO3/NaHCO3處理組骨材料在各個時間點(diǎn)均為1級;純化水處理組骨材料的細(xì)胞毒性為2～4級。掃描電鏡下觀察骨材料與MC3T3-E1細(xì)胞的相容性，結(jié)果顯示，MC3T3-E1細(xì)胞在脂肪酶及丙酮處理組骨材料骨小梁上附著生長，呈梭形或多角形，幾乎完全融合，覆蓋骨小梁;Na2CO3/NaHCO3處理組骨材料上僅有部分區(qū)域聚集成片生長，但保持梭形或多角形形態(tài);在純化水處理組骨材料上偶見細(xì)胞生長，呈圓形或卵圓形。皮下植入實(shí)驗結(jié)果顯示，在植入后第

9、1，4，12周各組材料均無明顯免疫排斥反應(yīng)及其他不良反應(yīng)。
　　 結(jié)論:脂肪酶可有效去除骨組織中的脂肪，脫脂過程時間短，不損傷骨組織表面結(jié)構(gòu)，且無毒性物質(zhì)殘留，應(yīng)用脂肪酶對骨移植材料進(jìn)行脫脂是改進(jìn)其制備過程的可行方法。
　　 第二章、同種骨膠原的提取制備及其理化性質(zhì)研究
　　 目的:脂肪酶法脫脂、稀鹽酸脫鈣、胃蛋白酶低溫條件下酶解骨組織提取骨膠原，檢測不同提純階段骨膠原的粘度、BMP含量、分子結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)及細(xì)胞

10、相容性，以制備滿足可塑形同種骨移植材料粘性載體性能要求的骨膠原。
　　 方法:無菌操作取大鼠四肢長骨，深低溫冰箱中凍存兩周，去除軟組織，超聲清洗、脂肪酶脫脂、冷凍干燥、粉碎成粒徑小于1mm的骨粉、0.6mol/L的HCl脫鈣。4℃條件下，浸泡在胃蛋白酶濃度為2.5g/L，PH值為2的乙酸溶液中，持續(xù)攪拌酶解72h。15000 r/min離心20min，取上清，并取出1/3，標(biāo)記為組1（粗提骨膠原）。剩余的上清液中加入NaCl晶體

11、10g，過夜沉淀。再次離心，取沉淀加入100ml0.5mol/L的乙酸溶液，過夜溶解，相同條件下再次離心，取上清，并取出1/2，標(biāo)記為組2（初步純化骨膠原）。剩余骨膠原溶液應(yīng)用5mol/L的NaOH溶液調(diào)整PH到7，加入NaCl晶體約10g，過夜沉淀。再次離心，取沉淀，加入50ml0.5mol/L乙酸溶液，過夜溶解，再次離心，取上清，標(biāo)記為組3（純化骨膠原）。將3組骨膠原溶液裝入透析袋中，置于20 mmol/L的Na2HPO4溶液中透析

12、8h，滅活胃蛋白酶，換用0.5mol/L醋酸溶液繼續(xù)透析48 h，以上操作均在4℃下進(jìn)行。將收獲的3組骨膠原溶液冷凍干燥。0.5mol/L的乙酸溶液溶解，分別配制濃度為0.2％的3組骨膠原溶液，37℃條件下，檢測3組骨膠原溶液粘度。分別配制濃度為1％的3組骨膠原溶液，按大鼠BMP ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組骨膠原中BMP含量。配制濃度為0.2％的3組骨膠原溶液，SDS-PAGE電泳法檢測其分子質(zhì)量分布情況。配制濃度為0.4％的

13、3組骨膠原溶液，以大鼠Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品溶液為對照，紫外可見分光光度計進(jìn)行光譜分析。將3組骨膠原輻照滅菌，以L-DMEM培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，按1.25cm2骨膠原膜表面積/ml培養(yǎng)基比例，在37℃條件下浸提72h制備各組骨膠原浸提液，以L-DMEM培養(yǎng)基為試劑對照。取對數(shù)生長期L929小鼠成纖維細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞毒性，計算細(xì)胞相對增殖率并進(jìn)行細(xì)胞毒性評級。另取制備的骨膠原膜，平鋪在6孔培養(yǎng)板底，將L929小鼠成纖維細(xì)胞以1×105個/

14、ml濃度接種在骨膠原膜上，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 結(jié)果:酶解后骨膠原混合物為無色、透明、粘稠液體，經(jīng)過鹽析、離心純化變得更加透明，冷凍干燥的骨膠原呈蓬松海綿狀，顏色潔白。粘度檢測結(jié)果顯示3組骨膠原均具有良好的粘度，分別為2383.33±202.07mPa.s，1643.33±80.21mPa.s，1480.00±80.00 mPa.s。粗提骨膠原粘度高于其余兩組純化骨膠原，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

15、0.01)。3組骨膠原中BMP含量分別為336.356±7.627ng/g，295.308±5.444 ng/g，284.111±4.291 ng/g，粗提骨膠原中BMP含量高于另外兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，初步純化骨膠原中BMP含量也高于純化骨膠原，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示提取的骨膠原主要由分子量約100KDa大小的膠原蛋白分子α1鏈和α2鏈，約200KDa大小的膠原蛋白分子β鏈，

16、以及少量分子量超過200KDa的多聚體組成。光譜分析檢測顯示，各組骨膠原吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)大鼠Ⅰ型膠原蛋白相似，最大吸收波長為232nm左右，符合Ⅰ型膠原吸收光譜特征，粗提骨膠原吸收峰最多，初步純化骨膠原、純化骨膠原吸收峰明顯減少。細(xì)胞毒性檢測結(jié)果顯示，各組骨膠原在不同時間點(diǎn)細(xì)胞相對增殖率均在95％以上，細(xì)胞毒性評級均為1級。形態(tài)學(xué)觀察，在3組骨膠原材料上培養(yǎng)的L929細(xì)胞均與正常L929細(xì)胞無明顯差異。
　　 結(jié)論:應(yīng)用脂肪酶脫脂

17、、稀鹽酸脫鈣、胃蛋白酶低溫酶解提取的骨膠原細(xì)胞毒性輕微，具有較高粘度，還含有一定量的BMP，具備成為可塑形同種骨修復(fù)材料粘性載體條件。只經(jīng)過酶解離心粗提骨膠原與鹽析純化骨膠原細(xì)胞相容性相似，但粘度及BMP含量均高于純化骨膠原，因此選擇粗提骨膠原作為可塑形同種骨修復(fù)材料的粘性載體較好。
　　 第三章、可塑形同種骨修復(fù)材料的制備及其生物相容性研究
　　 目的:按不同比例將同種DBM顆粒與粗提同種骨膠原復(fù)合制備可塑形同種骨修復(fù)

18、材料，并進(jìn)行可塑形能力、抗離散能力檢測確定兩者最佳復(fù)合比例，評價其細(xì)胞毒性和組織相容性，初步探討應(yīng)用同種DBM顆粒復(fù)合粗提同種骨膠原制備可塑形同種骨修復(fù)材料的可行性。
　　 方法:按第二章中方法制備并篩取粒徑為250～750μm的DBM顆粒及粗提同種骨膠原，輻照滅菌。在超凈工作臺上，加入無菌過濾的0.5mol/L的乙酸，分別配置濃度為0.75％、1.5％、3.0％、4.5％、6％的骨膠原溶液，使用時加5mol/L的NaOH調(diào)整P

19、H值為7。分別在各濃度組骨膠原溶液中按每毫升加入450mg DBM顆粒比例將兩者復(fù)合，混勻，觀察成形情況及可塑形能力。取相同體積各組可塑形同種骨修復(fù)材料，捏制成球形，放入六孔培養(yǎng)板中，加無菌PBS平衡液10ml，置入37℃恒溫箱中，在不同的時間點(diǎn)觀察各組材料的離散程度，檢測各組材料抗離散能力，篩選DBM顆粒與骨膠原最佳復(fù)合比例。將篩選的最佳復(fù)合比例的可塑形同種骨修復(fù)材料按0.1 g/mL培養(yǎng)基比例，37℃條件下在無血清L-DMEM培養(yǎng)基

20、浸提72h制備浸提液，以L-DMEM培養(yǎng)基為試劑對照，應(yīng)用L929小鼠成纖維細(xì)胞CCK-8法檢測細(xì)胞毒性。將DBM顆粒及可塑形同種骨修復(fù)材料植入大鼠皮下，以無毒聚乙烯片為陰性對照，進(jìn)行組織相容性評價。
　　 結(jié)果:各濃度組骨膠原與450mg DBM顆粒復(fù)合制備的可塑形同種骨修復(fù)材料均可成形，具有一定的可塑形能力。0.75％骨膠原濃度組可塑形同種骨修復(fù)材料較為松散，易碎;1.5％骨膠原濃度組材料可塑形能力有一定的提高，但仍較松散;

21、3％、4.5％骨膠原濃度組材料DBM顆粒間粘合緊密，可塑形能力強(qiáng);6％骨膠原濃度組材料，DBM顆粒間粘合緊密，但硬度較大，可塑形能力稍差。各組可塑形同種骨修復(fù)材料在37℃的PBS平衡液中均有一定的抗離散能力。2h時，0.75％骨膠原濃度組材料完全離散;4h時，1.5％、3％骨膠原濃度組材料完全離散;6h時所有組別材料均已離散。根據(jù)可塑形能力及抗離散能力檢測結(jié)果，確定每毫升濃度為4.5％骨膠原與450mgDBM顆粒，即DBM/骨膠原質(zhì)量比

22、為10/1，為兩者最佳復(fù)合比例?？伤苄瓮N骨修復(fù)材料在第1，4，7d細(xì)胞相對增殖率均在95％以上，細(xì)胞毒性級為1級。組織相容性評價，植入皮下后1周、4周及12周，DBM顆粒組、可塑形同種骨修復(fù)材料組的組織學(xué)反應(yīng)均與陰性對照組相差不大，未見明顯免疫排斥反應(yīng)及其他不良反應(yīng)。植入后4周，DBM顆粒組及可塑形同種骨修復(fù)材料組均可見DBM顆粒被吸收，周圍有間充質(zhì)細(xì)胞生長。12周時，DBM顆粒大部分被吸收降解，殘存DBM被排列成行的間充質(zhì)細(xì)胞包繞。

23、
　　 結(jié)論:將DBM顆粒與骨膠原以10∶1比例復(fù)合制備的可塑形同種骨修復(fù)材料具有良好的可塑形能力及抗離散能力，細(xì)胞毒性輕微且具有良好的組織相容性和生物可降解性。
　　 第四章、可塑形同種骨修復(fù)材料修復(fù)大鼠顱蓋骨缺損的實(shí)驗研究
　　 目的:建立大鼠顱蓋骨缺損模型，植入制備的可塑形同種骨修復(fù)材料，通過組織學(xué)評價（HE染色和Masson三色染色）、鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記、Micro-CT掃描評價其修復(fù)骨缺損的能力，為其將來

24、在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗基礎(chǔ)。
　　 方法:在超凈工作臺上，配制濃度為4.5％的同種骨膠原溶液，每毫升加入450mg同種DBM顆粒，充分混勻，制備可塑形同種骨修復(fù)材料。取體重為250g大鼠48只，隨機(jī)分成3組，腹腔注射麻醉，無菌操作暴露顱蓋骨，鋸取顱蓋骨，造成約6×6mm2骨缺損。按組別分別植入各組材料填充骨缺損，實(shí)驗分組為:DBM組，骨缺損區(qū)域植入粒徑為250～750μmDBM顆粒;可塑形同種骨修復(fù)材料組:骨缺損區(qū)域植入可塑形同

25、種骨修復(fù)材料;空白對照組，為陰性對照組，骨缺損區(qū)域不植入任何材料。分別于術(shù)后第4，8，12周每組隨機(jī)選取4只大鼠，處死取材，固定、脫鈣、石蠟包埋、組織學(xué)切片，HE染色和Masson三色染色，光鏡下觀察骨缺損區(qū)域的修復(fù)情況。術(shù)后11周時，每組隨機(jī)選取4只大鼠，肌肉注射鈣黃綠素溶液，標(biāo)記在此時間點(diǎn)新骨生成情況，1周后，處死取材、固定，塑料包埋，硬組織切片制作厚度為10μm的組織片，熒光顯微鏡下觀察。術(shù)后12周取材時所取標(biāo)本，每組隨機(jī)選取其中

26、1個樣本，固定48h，高分辨率Micro-CT掃描并三維重建。掃描結(jié)束后，對標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　 結(jié)果:在取材時，DBM組可見部分DBM顆粒從骨缺損區(qū)域擴(kuò)散移出，可塑形同種骨修復(fù)材料組也有少量材料從骨缺損區(qū)域擴(kuò)散移出，但絕大部分仍保持在植入部位?？瞻讓φ战M骨缺損區(qū)域被軟組織填充。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，術(shù)后4周，DBM組，骨缺損區(qū)域可見散在分布的DBM顆粒，間充質(zhì)細(xì)胞環(huán)繞DBM顆粒排列，DBM顆粒間有纖維結(jié)締組織生成。

27、可塑形同種骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域可見緊密排列的DBM顆粒， DBM顆粒周圍及間隙均有大量間充質(zhì)細(xì)胞分布，可見少量新生骨組織生成。空白對照組，骨缺損區(qū)域被纖維結(jié)締組織填充。術(shù)后8周，DBM組，骨缺損區(qū)域可見大量間充質(zhì)細(xì)胞沿DBM顆粒排列生長，DBM顆粒部分被吸收降解，有少量新生骨組織生成，DBM顆粒間隙仍可見纖維結(jié)締組織?？伤苄瓮N骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域被新生骨組織與DBM顆粒填充，新生骨組織包繞在殘存DBM顆粒周圍，DBM顆粒部分被

28、吸收降解，周圍有大量間充質(zhì)細(xì)胞?？瞻讓φ战M，骨缺損區(qū)域被纖維結(jié)締組織填充。術(shù)后12周，DBM組，骨缺損區(qū)域可見散在分布的DBM顆粒與新生骨組織，DBM顆粒與新生骨組織間隙可見纖維結(jié)締組織?？伤苄瓮N骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域被大量成熟板層骨及尚未完全降解吸收DBM顆粒填充，可見新生骨髓腔?？瞻讓φ战M，骨缺損區(qū)域仍被纖維結(jié)締組織填充，宿主骨邊緣可見少量新生骨組織。Masson三色染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，術(shù)后4周，DBM組，骨缺損區(qū)域可見被染

29、成橙黃色的DBM顆粒散在分布，周圍可見大量被染成綠色的疏松結(jié)締組織，DBM顆粒邊緣部分吸收降解，染成紅色;可塑形同種骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域可見橙黃色的DBM顆粒周圍及間隙均有大量橙黃色間充質(zhì)細(xì)胞密集分布;空白對照組，骨缺損區(qū)域被大量染成綠色的纖維結(jié)締組織填充。術(shù)后8周，DBM組，骨缺損區(qū)域染成橙黃色的DBM進(jìn)一步被吸收降解，染成紅色區(qū)域增多，周圍仍可見被染成綠色的纖維結(jié)締組織;可塑形同種骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域可見橙黃色DBM顆粒大部

30、分被吸收降解，染成紅色，周圍有大量被染成綠色的新生骨組織;空白對照組，骨缺損區(qū)域仍被染成綠色的纖維組織填充。術(shù)后12周，DBM組，骨缺損區(qū)域可見橙黃色的DBM顆粒被進(jìn)一步吸收降解，可見被染成綠色的新生骨組織;可塑形同種骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域可見橙黃色的DBM顆粒被進(jìn)一步吸收降解，周圍被大量染成淡紅色的有序成層排列成熟板層骨包繞;空白對照組，骨缺損區(qū)域仍被染成綠色的纖維組織填充。術(shù)后12周，鈣黃綠素標(biāo)記的標(biāo)本，硬組織切片，熒光顯微鏡下觀

31、察，DBM組，骨缺損區(qū)域僅有少量被鈣黃綠素標(biāo)記新生骨組織散在分布，發(fā)出綠色熒光點(diǎn);可塑形同種骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域新生骨組織數(shù)量較多，部分區(qū)域可見連續(xù)綠色熒光帶;空白對照組，骨缺損區(qū)域僅在宿主骨邊緣有少量綠色熒光點(diǎn)。術(shù)后12周，高分辨率Micro-CT掃描并三維重建，DBM組，骨缺損區(qū)域縮小，但大部分仍未完成骨修復(fù)，骨缺損邊緣可見宿主骨自我修復(fù)，宿主骨延伸區(qū)域外也可見高密度礦化新生骨組織?？伤苄瓮N骨修復(fù)材料組，骨缺損區(qū)域大部分被高密

32、度礦化骨組織填充，但仍未完全骨修復(fù)，缺損區(qū)域可見多個礦化骨組織點(diǎn)，均勻分布于骨缺損區(qū)域?？瞻讓φ战M，骨缺損區(qū)域也有一定程度的縮小，在宿主骨邊緣可見高密度礦化骨組織，其余區(qū)域未見高密度礦化點(diǎn)?？伤苄瓮N骨修復(fù)材料組骨缺損區(qū)域的骨組織量、礦化骨量、骨礦密度、礦化組織量、礦化組織密度和礦化骨體積分?jǐn)?shù)均優(yōu)于DBM顆粒組和空白對照組。
　　 結(jié)論:本研究中所制備的可塑形同種骨修復(fù)材料具有良好的修復(fù)骨缺損能力，良好的生物相容性及生物可降解性