虎皮楠生物堿體外抗腫瘤活性成分篩選及作用機制研究.pdf

1、目的：對從虎皮楠和牛耳楓中提取的虎皮楠生物堿進行體外抗腫瘤活性篩選，得到有效的抗腫瘤化學成分，并對其中的有效成分做進一步研究，以探明其抗腫瘤的作用機制，為該類化合物中新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供科學依據。
　　 方法：
　　 1、采用MTT法測定8種虎皮楠生物堿對A-549（人肺腺癌細胞株）、MCF-7（人乳腺癌細胞株）、HepG-2（人肝癌細胞株）、HeLa（人宮頸癌細胞株）和U-251（人神經膠質瘤細胞株）等5種腫瘤細胞

2、株的體外抗腫瘤活性，分別計算在24h、48h、72h后8種虎皮楠生物堿對不同腫瘤細胞的半數抑制濃度(IC50)，以篩選抗腫瘤活性較強的成分及敏感腫瘤細胞株；
　　 2、對篩選出的抑制腫瘤細胞增殖作用較強的4種虎皮楠生物堿deoxycalyciphyllineB、Daphnioldhanin D、Daphnioldhanin E、daphnioldhanine H做縮小各化合物的濃度梯度跨度（倍比稀釋）的處理，以便更好地觀察藥物在

3、不同時間、不同濃度時的作用效果以及時效、量效關系；
　　 3、對篩選出的抗腫瘤活性最好的化學成分Daphnioldhanin E和較敏感的HepG-2細胞，通過瑞一姬染色光學顯微鏡觀察、FDA-PI雙染熒光顯微鏡觀察、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞儀檢測及蛋白酶學分析等手段，初步探討Daphnioldhanin E在細胞、分子水平的抗腫瘤作用機制，為進一步的生物學活性研究奠定基礎。
　　 結果：
　　 1、虎皮楠

4、生物堿抗腫瘤活性的初步篩選
　　 結果顯示：8種虎皮楠生物堿中deoxycalyciphylline B、Daphnioldhanin D、Daphnioldhanin E、daphnioldhanine H等四種生物堿對所用的五種腫瘤細胞株均有一定的抑制作用，尤其是對HepG-2細胞的作用最為明顯，其IC50在72h后分別達到了4.94、2.24、1.17、3.44μg/mL;
　　 2、時效、量效關系的研究
　

5、　 隨著藥物濃度逐漸增加，4種虎皮楠生物堿對HepG-2細胞的抑制率也隨之增加，且抑制作用具有較好的時效和量效關系。此外，上述4種化合物在72h的IC50均小于1Oμg/mL，并且有明確的劑量依賴性關系，其中Daphnioldhanin E的作用效果最好，在24h、48h、72h的IC50分別達到了5.70、1.29、0.75μg/mL;
　　 3、作用機制的研究
　　 (1)形態(tài)學觀察：瑞姬氏染色的光學顯微鏡下觀察到

6、HepG-2細胞經小劑量（lOμg/ml)的Daphnioldhanin E處理后，細胞體積增大，細胞核清晰可見，周圍出現了大量的胞漿空泡，但細胞膜仍保持完整，而隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，細胞膜完整性開始遭到破壞，最終致細胞核破碎，且伴隨著整個細胞的密度大幅降低；
　　 (2) DNA梯帶電泳：瓊脂糖凝膠電泳檢測Daphnioldhanin E作用HepG-2細胞后，電泳中出現了大量50-200bp小片段，未見凋亡特征

7、性的DNA梯狀條帶；
　　 (3)流式細胞儀檢測：小劑量的Daphnioldhanin E(1Oμg/mL)在作用HepG-2細胞24、48、72h_個時間點后，早期凋亡細胞的凋亡率較對照組無明顯變化(P>0.05)，晚期凋亡率和壞死率明顯增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；而大劑量組(30μg/mL)在24、48、72h_個時間點后，早期凋亡細胞的凋亡率較對照組有所增加(P<0.05)，但比例不大，分別為（6.34±0.8

8、9）％、（9.16±0.32）％、（11.67±0.40）％；晚期凋亡率和壞死率亦明顯增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；
　　 (4)熒光顯微鏡觀察：在作用24h后，空白對照組和Daphnioldhanin E組以綠色熒光為主，表明以上兩組細胞胞膜未發(fā)生破損，PI未能染色，提示Daphnioldhanin E在作用于HepG-2細胞的早期未出現大量壞死，而凋亡陽性對照組紅色熒光明顯增多，表明細胞壞死或晚期凋亡細胞的數量增加

9、；
　　 (5)凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對Daphnioldhanin E抑瘤活性影響的研究：兩個濃度的Daphnioldhanin E未受Z-VAD-FMK的影響，殺傷作用明確；
　　 (6) caspase3酶活性的檢測：Daphnioldhanin E處理組與正常對照組比較，HepG-2細胞caspase-3酶活力值無明顯變化，說明細胞死亡過程中caspase-3沒有被活化。
　　 結論：
　　

10、 1、8種虎皮楠生物堿中有4種(deoxycalyciphylline B、Daphnioldhanin D、Daphnioldhanin E、daphnioldhanine H)對五種組織來源的腫瘤細胞株有明顯的抑制作用，且呈時間劑量依賴性，其中Daphnioldhanin E對HepG-2細胞的抑瘤活性最強；
　　 2、Daphnioldhanin E可能通過誘導HepG-2細胞發(fā)生亞凋亡(Paraptosis)而發(fā)揮抗腫瘤