黃海養(yǎng)殖真海鞘脂溶性成分的分離純化.pdf

1、海鞘中富含結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的生理活性物質(zhì)，已有多個具抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物從海鞘中被分離鑒定。真海鞘是一種大型海鞘，目前在山東威海地區(qū)試養(yǎng)成功，現(xiàn)已形成規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，但已有的研究中鮮少涉及對黃海養(yǎng)殖真海鞘化學成分的報道。本實驗采用生化分離手段，對真海鞘脂溶性提取物進行分離純化和抗腫瘤活性篩選，以期得到活性單體化合物，并確定其結(jié)構(gòu)。
　　采用乙酸乙酯、正丁醇、乙醇三種有機溶劑依次對真海鞘凍干粉進行提取，得到三種有機溶劑提取物，再

2、從乙酸乙酯提取物中萃取得到石油醚提取物。采用硅膠層析柱、凝膠層析柱、大孔樹脂層析柱、制備型高效液相色譜等方法分別對乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、乙醇提取物進行分離純化，石油醚提取物利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定化合物種類及含量。采用MTT法對各提取物分離組分進行細胞增殖抑制活性測定。
　　500 Kg新鮮真海鞘去皮、冷凍干燥、粉碎得到27 Kg凍干粉，20 Kg凍干粉使用乙酸乙酯提取得到716 g提取物，呈暗紅色的粘稠油狀物；石油醚提

3、取物150.2 g，呈透明的玫紅色油狀物；正丁醇提取物420 g，呈黑褐色的粘稠油狀物；乙醇提取物354 g，呈黑褐色的粘稠油狀物。
　　GC-MS檢測結(jié)果顯示石油醚提取物中主要為各種脂肪酸，包括棕櫚酸、油酸、肉豆蔻酸、硬脂酸及EPA、DHA等多種脂肪酸。其中棕櫚酸含量最高，為21.28％， EPA、DHA含量較高，分別為8.41%、6.02%。
　　乙酸乙酯提取物硅膠層析柱分離得到39個組分，根據(jù)細胞活性實驗結(jié)果以及組分特

4、性，選擇乙1A18號繼續(xù)分離，通過多次硅膠柱層析、凝膠柱層析分離得到乙1A18+B2C6。樣品乙1A18+B2C6經(jīng)GC-MS測定，含有6個化合物，分別是2,6,10,14,18,22-二十二碳烯、4-（（1S，2S，7S，11S，16S，5R，9R，10R，14R，15R）-5,9,16-三羥基-2,15-二甲基十七烷-4-甲基）戊酸乙酯、膽甾醇壬酸酯、膽甾醇、豆甾醇、26-同型-25-羥基膽固醇。采用高效液相制備色譜對乙1A18+B

5、2C6分離純化，得到6個組分乙1A18+B2C6d1~乙1A18+B2C6d6，乙1A18+B2C6d4經(jīng)核磁共振鑒定為膽甾醇。
　　正丁醇提取物經(jīng)過硅膠層析柱分離得到11個組分，乙醇提取物經(jīng)過大孔樹脂層析柱分離得到6個組分，各組分組成較復(fù)雜，有待進一步分離。
　　人體肝癌細胞7721的增殖抑制實驗結(jié)果顯示：石油醚粗提物對7721細胞增殖有一定的抑制作用；乙酸乙酯提取物分離組分乙1A18+、乙1A18+B2C6對7721細胞